Химические ампутации и регенерации глотки в Планарии Schmidtea mediterranea
Summary
Планарии Schmidtea mediterranea является прекрасной моделью для изучения стволовых клеток и регенерации тканей. Эта публикация описывает метод выборочно удалить один орган, глотки, подвергая животных для азид химического натрия. Этот протокол также излагаются методы мониторинга глотки регенерации.
Abstract
Planarians, трематодами, которые являются чрезвычайно эффективными в регенерации. Они задолжают эта способность большое количество стволовых клеток, которые могут быстро реагировать на любой тип травмы. Общие травмы модели в этих животных удалить большое количество ткани, которая наносит ущерб несколько органов. Чтобы преодолеть этот ущерб широких тканей, мы описываем здесь метод для выборочного удаления единым органом, глотки, в Планарии Schmidtea mediterranea. Мы добиться этого путем замачивания животных в растворе, содержащие азид натрия ингибитором цитохрома-оксидазы. Кратковременного воздействия азид натрия вызывает выдавливания глотки от животного, которое мы называем «химическая ампутации.» Химические ампутации удаляет весь глотки и создает небольшую рану, где глотки придает кишечника. После ополаскивания обширные, ампутировали животные регенерировать полностью функциональный глотки в течение примерно одной недели. Стволовые клетки в остальной части тела диск регенерации новых глотки. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для химических ампутации и описать гистологические и поведенческие методы для оценки успешных ампутации и регенерации.
Introduction
Регенерация представляет собой явление, которое происходит во всем животном, с регенеративной емкостью от регенерации тела в некоторых беспозвоночных более ограниченной способности в позвоночных1. Замена функциональных тканей — это сложный процесс и часто влечет за собой одновременное восстановление нескольких типов клеток. Например для регенерации конечностей саламандра, остеобласты, хрящевые клетки, нейронов, мышц и эпителиальные клетки должны быть заменены2. Эти типы созданный клеток также должны быть организованы должным образом содействовать новой функции конечности. Понимание этих сложных процессов требует методов, которые сосредоточены на регенерации типов конкретных клеток и их интеграции в органы.
Одна из стратегий, используемых для упрощения изучение восстановительных реакций является целевой абляции либо определенные типы клеток или больших коллекций тканей. Например в данио рерио, выражение nitroreductase в типах конкретных клеток приводит к их разрушению после применения метронидазол3,4. В личинки дрозофилы выражения про apoptotic гены под ткани конкретных промоутеров может выборочно удалять конкретные регионы имагинальных дисков5,6. Оба из этих стратегий быстрого, но контролируемые повредить и были использованы для того чтобы рассечь молекулярных и клеточных механизмов, отвечающих за регенерацию.
В этой рукописи мы опишем способ выборочно удалять весь орган, называемый глотки в Планарии Schmidtea mediterranea. Planarians являются классической модели регенерации, известный для их плодовитый регенерационной способности, где даже минута фрагменты можно вырастить весь животных 7,8. Они имеют большой, гетерогенных население стволовых клеток, состоящий из плюрипотентных клеток и восходящей линии ограничена9,10,11. Эти клетки размножаются и дифференцировать для замены всех отсутствующих тканей, в том числе глотки, нервной, пищеварительной и выделительной систем и мышцы и эпителиальных клеток9,10,12. Хотя мы знаем, что эти стволовые клетки инициировать регенерации, мы не полностью понимаем молекулярные механизмы, которые управляют их заменить всех этих различных типов клеток. Определенных ранив методы, которые вызывают точные стволовых клеток ответов могут помочь определить этот сложный процесс.
Глотки большой, цилиндрические трубки, необходимых для кормления и содержит нейронов, мышцы, эпителиальных и секреторные клетки13,29. Обычно скрыты в чехле на вентральной стороне животного, он простирается через единый орган животного, открытие после зондирования присутствие пищи. Чтобы выборочно ампутировать глотки, мы замочить planarians в азид химических называется натрия, широко используемых анестетика в C. elegans14,,1516. Его использование в planarians впервые сообщили Адлер и др., в 2014 году12. В течение нескольких минут воздействия азид натрия planarians выдавливать их фарингит, и с нежным агитации, глотки отсоединяется от животного. Мы ссылаемся на этот полный и выборочный потери глотки как «химическая ампутации конечностей». Через одну неделю после ампутации, полностью функциональный глотки находится восстановленный12. Потому что глотки требуется для кормления, функциональных регенерации может измеряться путем мониторинга питания поведение. Ниже мы описываем протокол для химического ампутации и для оценки регенерации глотки и восстановления кормления поведение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод выборочного уноса глотки с помощью азид натрия. Другие исследования целевых абляции в planarians использовали измененные хирургии для удаления фоторецепторов21 или медикаментозное лечение, чтобы удалять дофаминергические нейроны22. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Алехандро Санчес Альварадо, который поддержал первоначальный оптимизации и развития этой техники. Работа в лаборатории Кэролин Adler поддерживается Корнельского университета начальных средств.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
