Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea
Summary
Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.
Abstract
Planarien sind Plattwürmer, die äußerst effizient auf Regeneration. Sie verdanken diese Fähigkeit, eine große Anzahl von Stammzellen, die auf jeder Art von Verletzungen schnell reagieren können. Häufige Verletzungen Modelle in diesen Tieren entfernen Sie große Mengen von Gewebe, die mehrere Organe schädigt. Um dieses breite Gewebeschäden zu überwinden, beschreiben wir hier eine Methode, um gezielt ein einzelnes Organ, des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaentfernen. Dies erreichen wir durch Einweichen Tiere in eine Lösung mit der Cytochrom-Oxidase-Hemmer Natriumazid. Kurze Exposition gegenüber Natriumazid verursacht Extrusion des Rachens vom Tier, nennen wir “chemische Amputation.” Chemischen Amputation entfernt den gesamten Rachenraum und erzeugt eine kleine Wunde, wo der Pharynx in den Darm legt. Nach umfangreichen spülen, regeneriert alle Amputierte Tieren eine voll funktionsfähige Rachen in etwa einer Woche. Stammzellen in den Rest des Körpers fahren Regeneration des neuen Rachens. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum chemischen Amputation und histologische und Verhaltensstörungen Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Amputation und Regeneration zu beschreiben.
Introduction
Regeneration ist ein Phänomen, das im gesamten Tierreich, mit regenerativen Kapazitäten von Ganzkörper-Regeneration in bestimmten Wirbellosen bis hin zu mehr eingeschränkten Fähigkeiten in Wirbeltieren1auftritt. Ersatz von funktionellen Geweben ist ein komplexer Prozess und oft bringt die gleichzeitige Wiederherstellung mehrere Zelltypen. Zum Beispiel Salamander Gliedmaßen, Osteoblasten, Chondrozyten, Nervenzellen, Muskeln und Epithelzellen müssen sich regenerieren2ersetzt. Außerdem müssen diese neu erzeugten Zelltypen richtig organisiert werden, um die neue Funktion der Gliedmaße zu erleichtern. Das Verständnis dieser komplexen Prozesse erfordert Techniken, die auf Regeneration von bestimmten Zelltypen und ihre Integration in die Organe zu konzentrieren.
Die Strategien, die Studie der regenerativen Antworten zu vereinfachen gehört die gezielte Ablation von bestimmten Zelltypen oder größere Sammlungen von Geweben. Beispielsweise führt die Expression des Nitroreductase in bestimmten Zelltypen im Zebrafisch, zu deren Vernichtung nach Anwendung von Metronidazol3,4. In Drosophila -Larven Abtragen mit dem Ausdruck Pro-apoptotische Gene unter gewebespezifische Promotoren gezielt bestimmte Regionen des imaginalen Scheibe5,6. Beide dieser Strategien rasch, aber kontrollierten Schaden anrichten, und wurden verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen für die Regeneration verantwortlich zu sezieren.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode, um eine ganze Organ namens des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaselektiv abtragen. Planarien sind ein klassisches Modell der Regeneration, bekannt für ihre fruchtbaren Regenerationsfähigkeit, wo selbst kleinste Fragmente ganze Tiere 7,8wieder nachwachsen. Sie haben eine große, heterogene Bevölkerung von Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen und Linie beschränkt Stammväter9,10,11. Diese Zellen vermehren sich und differenzieren, um alle fehlenden Gewebe, einschließlich des Rachens, Nerven-, Verdauungs- und Ausscheidungsorgane Systeme und Muskel und Epithelzellen9,10,12zu ersetzen. Wir wissen, dass diese Stammzellen Regeneration einzuleiten, tun wir nicht vollständig verstehen Sie, die molekularen Mechanismen, die sie zu diesen verschiedenen Zelltypen ersetzen fahren. Definierte verletzte Methoden, die präzise Stammzellen Reaktionen auslösen können helfen, diesen komplexen Prozess abzugrenzen.
Der Pharynx ist eine große, zylindrische Röhre benötigt für die Fütterung und enthält Neuronen, Muskel, epithelialen und sekretorischen Zellen13,29. Normalerweise versteckt in einer Tasche an der Bauchseite des Tieres, es erstreckt sich über einzelne Körper des Tieres auf das Vorhandensein von Nahrung sensing öffnen. Um selektiv den Pharynx amputieren, genießen wir Planarien in einer chemischen genannt Natriumazid, eine häufig verwendete Anästhetikum in C. Elegans14,15,16. Seine Verwendung in Planarien wurde erstmals berichtet, von Adler Et Al., 2014-12. Innerhalb von Minuten der Exposition gegenüber Natriumazid Planarien extrudieren Sie ihre Pharynges und mit sanften Agitation des Rachens trennt das Tier. Dieser vollständige und selektiven Verlust des Rachens bezeichnen wir als “chemische Amputation”. Eine Woche nach der Amputation, ist eine voll funktionsfähige Rachen restaurierten12. Da Rachens für Fütterung erforderlich ist, kann funktionelle Regeneration gemessen werden, durch die Überwachung Fressverhalten. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll für chemische Amputation und für die Beurteilung der Regeneration des Rachens und Wiederherstellung der Fressverhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur selektiven Abtragen des Rachens mit Natriumazid. Weitere gezielte Ablation Studien in Planarien haben geänderte Chirurgie verwendet, um Photorezeptoren21 oder pharmakologische Behandlung zu dopaminergen Neuronen22abtragen zu entfernen. Ein großer Vorteil der chemischen Amputation über bestehende Methoden ist, dass es keine Operation erfordert. Die starre Struktur des Rachens verglichen mit dem Rest des Körpers Planarian erlei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Alejandro Sánchez Alvarado, danken, die die anfänglichen Optimierung und Entwicklung dieser Technik unterstützt. Im Carolyn Adler Labor ist von Cornell University Startkapital unterstützt.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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