化学の切断とSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭再生
Summary
プラナリアSchmidtea メディテラネアは、幹細胞と組織再生を研究するための優れたモデルです。この文書では、化学のアジに動物を公開することによって 1 つの器官、咽頭を選択的に削除する方法について説明します。このプロトコルはまた咽頭再生を監視する方法を説明します。
Abstract
プラナリアは、扁形動物の非常に効率的な再生です。彼らは、任意のタイプの傷害に即応できる幹細胞の数が多いこの能力を借りています。これらの動物の共通の傷害モデルは、複数の臓器に損傷組織の大量を削除します。この広範な組織の損傷を克服するために我々 はSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭、一つの臓器を選択的に削除する方法をここで説明します。我々 はチトクロム酸化酵素阻害剤アジ化ナトリウムを含む溶液に浸漬の動物によってこれを達成します。アジ化ナトリウムを簡単に暴露により咽頭の押出成形、「化学的切断」と呼ばれる動物から化学切断全体の咽頭を削除し、咽頭が腸へアタッチ小さな傷を生成します。広範な洗浄後は、すべての切断された動物は、約 1 週間で咽頭が完全に機能を再生成します。体の残りの部分の幹細胞は、新しい咽頭の再生を駆動します。ここで、詳細な提供化学切断のプロトコルおよび成功の切断と再生を評価する組織と行動の両方の方法について説明します。
Introduction
再生は、再生能力ある無脊椎動物の完全なボディ再生から脊椎動物1のより制限された能力に至るまで動物界全体が発生する現象です。機能的な組織の交換は複雑なプロセスであり、種類の細胞の同時復元をしばしば伴います。たとえば、サンショウウオの四肢、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞、筋肉とする上皮細胞に必要なを再生成するには、2を置き換えられます。これらの細胞が新たに生成された型はまた新しい下肢の機能を容易にするために適切に編成する必要があります。これらの複雑なプロセスを理解すると、特定の細胞のタイプおよび器官への統合の再生に焦点を当てる技術が必要です。
再生反応に関する研究を簡素化する採用戦略は、いずれかの特定の細胞型のターゲットの切除や組織の大規模な収集があります。たとえば、ゼブラフィッシュ、特定の細胞型でニトロの式はメトロニダゾールの3、4を適用した後彼らの破壊に します。ショウジョウバエ幼虫の組織特異的発現プロモーター下プロ アポトーシス遺伝子を表現するには成虫ディスク5,6の特定の領域を切除できることは選択的に。両方これらの戦略の急速な制御された損傷の原因し、再生の分子・細胞メカニズムを解剖に使用されています。
本稿では、我々 はSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭と呼ばれる全体の器官を選択的に切除する方法をについて説明します。プラナリアが再生、その多作の再生能力で知られての古典的なモデルも分の断片が全体動物7,8を再生することができます。彼らは幹細胞の多能性細胞と前駆細胞の血統制限9,,1011から成る大規模な異種の人口があります。これらの細胞は、増殖し、咽頭、神経系、消化と排泄系と筋上皮細胞9,10,12など、すべての不足している組織を置換するを区別します。これらの幹細胞が再生を開始することを私たちは知っている、すべてのこれらの異なった細胞のタイプを交換するそれらを駆動する分子メカニズムは完全に納得しません。正確な幹細胞応答を引き出す定義の人が負傷した方法は、この複雑なプロセスを明確に役立ちます。
咽頭の授乳に必要な大規模な円筒形のチューブであり、神経細胞、筋肉、上皮細胞と分泌細胞13,29を含んでいます。通常動物の腹部の側面のポーチに隠された、それは食品の存在を感じる時に開く動物の単一ボディに引かれます。咽頭を選択的に切断、化学と呼ばれるナトリウムのアジ化物、線虫14,15,16の一般的に使用される麻酔薬でプラナリアを浸します。プラナリアのアドラーらによって報告された。、201412で。アジ化ナトリウムへの露出の数分以内プラナリア押し出し、pharynges と穏やかな攪拌と咽頭を動物から切り離します。私たちは「化学切断」として咽頭の完全かつ選択的損失額を参照してください。切断後 1 週間完全に機能的な咽頭は復元された12です。咽頭は、供給する必要があるので、機能再生は摂食行動を監視することによって測定できます。化学の切断および咽頭の再生と摂食行動の回復を評価するためのプロトコルをご紹介いたします。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、アジ化ナトリウムを使用して咽頭の選択的アブレーションの方法について説明します。プラナリアの他のアブレーションの対象となる研究は、視細胞21または22ドーパミン作動性ニューロンをアブレーションするのに薬物治療を削除するのに修正手術を使用しています。既存の方法と比べて化学切断の 1 つの重要な利点は、手術が必要…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
初期の最適化と本手法の開発を支えたアレハンドロ ・ サンチェス アルバラドに感謝したいと思います。キャロリン ・ アドラー研究所での仕事は、コーネル大学スタートアップ資金によってサポートされます。
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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