Een protocol voor de winning van een chaperone periplasmische overgangsmetalen in het kader van haar eigen bindende partners, en biofysische karakterisering van de inhoud van het substraat door Röntgen fluorescentie en radiometal opname wordt gepresenteerd.
We tonen een schaalbare methode voor de scheiding van de bacteriële periplasma van het cytoplasma. Deze methode wordt gebruikt voor het zuiveren van de periplasmatische eiwitten ten behoeve van biofysische karakterisering en maatregel substraat overdracht tussen periplasmische en cytoplasmatische compartimenten. Door de tijd die het periplasma is gescheiden van het cytoplasma zorgvuldig te beperken, kan de experimentator pak de proteïne van belang en gehaltebepaling van elk compartiment afzonderlijk voor substraat zonder “Carry-over” besmetting tussen compartimenten. De uitgepakte eiwit uit fractionering kan vervolgens verder worden geanalyseerd voor driedimensionale structuurbepaling of substraat-bindende profielen. Als alternatief, kan deze methode worden uitgevoerd na incubatie met een radiotracer te bepalen totale percentage opname, evenals de verdeling van de tracer (en vandaar metal vervoer) over verschillende bacteriële compartimenten. Experimenten met een radiotracer kan helpen onderscheid maken tussen een fysiologische substraat en artefactual substraat, zoals die door mismetallation veroorzaakt.
Röntgen fluorescentie kan worden gebruikt om te ontdekken van de aanwezigheid of afwezigheid van metalen opneming in een steekproef, evenals wijzigingen voordoen bij de opneming van de metalen als een product en/of groei voorwaarden, voorwaarden van zuivering, kristallisatie voorwaarden meten. Röntgen fluorescentie biedt ook een relatieve maatstaf voor overvloed voor elk metaal, die kan worden gebruikt om te bepalen van de beste metalen energie absorptie piek te gebruiken voor abnormale verzamelen van de gegevens van de verstrooiing van de X-ray. Radiometal opname kan worden gebruikt als een methode om te valideren van de fysiologische aard van een substraat gedetecteerd door Röntgen fluorescentie, evenals het ondersteunen van de ontdekking van nieuwe substraten.
Bij gram-negatieve bacteriën, zijn cytoplasmatische zwembaden van overgangsmetalen atomen verhoogd en aangevuld door de binnenste membraan ABC (ATP-binding cassette) importeurs die metalen translocatie over het binnenste membraan verzachten. Periplasmische Cluster A-1 substraat-bindende proteïnen (SBPs) vormen een groep van chaperones die de metalen atomen direct binden en ferry hen via het periplasma te leveren aan cognaat ABC importeurs1. Andere Clusters van SBPs zijn speciaal voor het vervoer van substraten, zoals chelaatvormige metaal (Cluster A-2), koolhydraten (Clusters B en D-1) en aminozuren (Clusters B, C, F-2 en F-4); Toch volgen de SBPs ongeacht substraat, een evolutionair geconserveerd c-clamp Vouw2. De veralgemeende voorgestelde mechanisme voor de SBP substraat overdracht omvat de c-klem ondergaan een aantal bochten die lijken op een Venus flytrap3. Cluster A-1 SBPs zuiveren in het algemeen, in de vorm van een holo (metaal-bound), hoewel de studie van deze SBPs wordt beperkt door de moeilijkheid bij het genereren van apo (metaalvrije) vormen van eiwit voor experimenten4. Tot op heden, strategieën te bestuderen apo Cluster A-1 SBPs zijn beperkt tot mutagenese, dialyse, en gedeeltelijke denaturatie met ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) complexvormer5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. structurele gegevens die afkomstig zijn van deze experimenten blijkt dat Cluster A-1 SBPs niet juist het Venus flytrap mechanisme kan volgen. Momenteel ontbreekt in de literatuur is een methode voor de productie van apo Cluster A-1 SBPs in vivo gebruikmaakt van fysiologische bindende partners.
We laten zien voor de eerste keer met behulp van cel fractionering te zuiveren van YfeA, een Cluster A-1 SBP van Yersinia pestis, het etiologische agens van Pest, die werd omgebouwd tot het apo-formulier via interactie met zijn fysiologische cognaat YfeBCDE ABC-importeur in de cel. Wij tonen dat yfea is in de vorm van de apo door energie-dispersive X-ray spectroscopie (EDS), ook bekend als X-ray fluorescentie. We tonen ook YfeBCDE functionaliteit door het combineren van cel fractionering met hooggevoelige radioactief metalen opname studies onderscheid maken tussen metalen opname over de buitenmembraan en metalen importeren in het binnenste membraan. Het gebruik van een radioactieve tracer maakt het mogelijk voor de detectie van pg/L hoeveelheden metalen, veel lager is dan de limiet van detectie voor dergelijke technieken als inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of atomaire absorptie spectroscopie (AAS). Dit zorgt voor minimale verstoring van het systeem wordt bestudeerd. Bovendien vereisen de traditionele methoden die vaak grotere hoeveelheden van het monster, extra nabewerkingen en langere turn-around tijden, die niet typisch voor radiotracer testen zijn. Het biedt dus een handige en eenvoudige methode voor het toezicht op metalen distributie en opname binnen een cel met behulp van een radiotracer. Het moet nog worden vastgesteld als een apo die cluster A-1 SBP geproduceerd met behulp van deze methode de structurele observaties van de huidige praktijken gebruikt voor het genereren van apo eiwit zou echo.
Cel fractionering is een gevestigde methode voor het scheiden van cellulaire compartimenten impliciete ten behoeve van specifiek indringende hun inhoud in isolatie12. Cel fractionering wordt vaak gebruikt om te bevestigen de locatie van een molecule tijdens de celcyclus of meten van de activiteit van een bepaalde compartiment13. Bijvoorbeeld, kan metalen vervoersactiviteit vehiculumcontrolegroep worden door indringende cellulaire compartimenten voor metalen substraat. Integratie van cel fractionering maakt onderscheid en vergelijking tussen metalen opname over de buitenmembraan en metalen overdracht over het binnenste membraan. Deze processen kunnen dan op hun beurt na verloop van tijd worden gemeten. In het geval van EiwitReiniging, de meest voorkomende methoden van lysis van de cel en scheiding van oplosbare componenten van onoplosbare componenten zijn mechanische storingen (dat wil zeggen, malen, het mengen), hogedruk homogenisering (, de pers van de cel van de Franse druk, cel ontregelt), en ultrasone frequenties (dwz., ultrasoonapparaat)14. Gebruik van ultrasone frequenties lyse cellen is over het algemeen geschikt voor kleine volumes; echter, ultrasoonapparaat is bekend voor het genereren van warmtebronnen die kan het denatureren van eiwit. Om te voorkomen dat het genereren van extreme hitte, worden ultrasone frequenties meestal toegepast in sequentiële korte uitbarstingen, die kunnen worden tijdrovend en per ongeluk het degraderen van DNA moleculen in kleinere fragmenten. Bovendien kunnen meerdere dure ultrasoonapparaat sondes worden verlangd voor voorbereidende en analytische experimenten, als elke sonde heeft een beperkt bereik voor het monstervolume dat kan worden verwerkt. Gebruik van hoge druk lyse cellen voorkomt het genereren van overmatige hitte tijdens lysis van de cel door druk van de Franse pers celbestanddelen voorafgaand aan cellysis koelen of die een disruptor cel in een koude omgeving zoals een koude kamer. Zoals ultrasoonapparaat sondes wellicht meerdere sets van Franse druk celbestanddelen press worden gekocht om te verwerken van een breed scala van monster volumes. Franse druk de pers van de cel assemblages zijn eenvoudig aan te sluiten maar lastig te bedienen en te reinigen, kan zwaar om te verplaatsen en zijn gevoelig voor de verstopping van dichte monsters. Voordelen van het gebruik van ultrasone frequenties en hogedruk systemen lyse cellen bevatten veel monsters herstel, mogelijkheid voor het verwerken van meerdere monsters met minimale kruisbesmetting, en verstelbare schuintrekken van kracht, die kunnen worden aangepast voor lysis van de optimalisering van een breed scala van soorten van de steekproef. Optimalisatie kan optreden door het aanpassen van de ultrasone frequentie, duur van de uitbarstingen, zuiger druk pond per vierkante inch (psi), en aantal passeert de pers. Gebruik van mechanische verstoring van lyse cellen kan de technisch meest triviale en minst dure strategie voor lysis van de cel. Mechanische verstoring kan uitdagingen aanwezig in monster herstel en is niet ideaal voor de verwerking van meerdere monsters. Mechanische verstoring is zachter aan samples dan hoge druk of ultrasone frequenties, maar is niet hoge doorvoer en is vatbaar voor lysis van de inefficiënte. Een belangrijke experimentele beperking van de verstoring van de mechanische, hogedruk homogenisering en ultrasone frequenties, is de oncontroleerbare verstoring van de gehele cellulaire architectuur zodanig dat na lysis, alle waterige cel componenten worden gemengd samen. Bovendien, alle compartimenten van de cel niet verstoren op hetzelfde moment; inhoud van compartimenten die vroeg lyse kunnen daarom onderworpen aan voortdurende ontwrichtende krachten langer dan de inhoud van de compartimenten die lyse laat. Cel fractionering maakt goedkope, technisch eenvoudig, efficiënt compartiment gebaseerde scheiding van celinhoud terwijl het vermijden van de noodzaak voor dure apparatuur en monster blootstelling aan harde, ontwrichtende krachten.
In het geval van de SBP, geïmporteerde substraat is opnieuw naar potentieel apo eiwit en regenereert holo eiwit tijdens cellysis, voorafgaand aan downstream chromatografie of andere zuivering technieken. Opneming van de complexvormer EDTA tijdens cellysis is een extra belemmering, waar metalen affiniteit als een eerste stap van eiwitreiniging niet mogelijk is omdat EDTA zal strippen van metaal uit de hars van de chromatografie en voorkomen van eiwit bindend15. Een eenvoudige en goedkope oplossing is cel fractionering door osmotische schok, waar differentiële centrifugeren en gemeenschappelijke laboratoriumreagentia de onderzoeker zorgvuldig uitpakken van voldoende eiwit voor functionele analyse toelaten. Osmotische schok fractionering maakt gebruik van een tweestaps verandering in de osmotische druk om te scheiden van de cellulaire compartimenten. In de eerste plaats een hypertonic buffer cellen veroorzaakt om crenate zoals water elke cel verlaat en anderzijds een hypotone buffer cellen te zwellen als water opnieuw elke cel binnenkomt veroorzaakt. Door een zorgvuldige controle hoe lang de cellen zwellen, de buitenste membranen kunnen selectief worden lysed (als gevolg van de ophoping van de osmotische druk van het inkomende water), dus de inhoud in de buffer leegmaken. Behoud van de innerlijke membranen zorgt ervoor dat de cytoplasmatische inhoud worden bewaard in spheroplasts, en gemakkelijk van periplasmische inhoud door middel van centrifugeren gescheiden zijn.
YfeA is een polyspecific SBP staat van bindende ijzer, mangaan en zink atomen16. De relatieve verhoudingen van opgenomen metaal kan worden gewijzigd volgens metalen suppletie tijdens de groei, en vehiculumcontrolegroep door Röntgen fluorescentie zoals is beschikbaar bij Argonne National Laboratory’s geavanceerde Photon bron16. Röntgen fluorescentie in staat stelt de onderzoeker om snel een brede vergadering van metalen zonder de noodzaak voor grote of diffractie kwaliteit kristallen, en kan zelfs het achterhalen van gegevens uit eiwit neerslag of eiwithoudende oplossing.
Röntgen fluorescentie kan snel onthullen onverwachte resultaten zoals, in dit geval de primaire YfeA substraat wordt zink en niet de gedocumenteerde fysiologische substraten ijzer of mangaan16. Gebruikt voor het verzamelen van X-ray scattering gegevens, kan Röntgen fluorescentie de onderzoeker in de proefopzet, zoals welke metalen energie edge(s) om te gebruiken voor abnormale verzamelen van de gegevens van de verstrooiing van de X-ray informeren. Net zo nuttig als het bepalen van de relatieve overvloed van een metaal, X-ray-fluorescentie kunt ook bepalen of een metaal afwezig in een steekproef, bieden een snelle methode kristallen die apo eiwitten uit holo eiwitten bevatten, en het schatten van metaal te scheiden signaalsterkte zonder de behoefte aan tijdrovende gegevensverwerking. Bij het identificeren van een monster met een sterk signaal van de metalen, kan de exacte golflengte te gebruiken voor abnormale X-ray scattering gegevensverzameling worden bepaald door meerdere-golflengte abnormale dispersie (MAD) scan.
Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om te helpen nieuwe onderzoekers met succes uitvoeren van cel fractionering en maak effectief gebruik van synchrotron beamline hardware profile metalen totaalgehalte en verder van de studie van metaal-bindende proteïnen.
Cel fractionering is een nuttig hulpmiddel voor specifiek het sonderen van de inhoud van een cellulaire compartiment, en kan dienen als een nuttig instrument voor het extraheren van kleine molecules zoals metalen atomen, evenals macromoleculen zoals eiwitten. Het is vermeldenswaard dat cel fractionering is niet een absolute techniek en foutgevoelig zonder zorgvuldige aandacht voor mengen/resuspensie, incubatietemperatuur en incubatietijd kan worden. Onvolledige mengen kan leiden tot minimale membraanachtig lysis en dus te verwaarlozen fractionering, fractionering bij kamertemperatuur kan leiden tot snelle lysis van beide membranen leidt tot verontreiniging van de periplasmatische breuk met cytoplasmatische inhoud, en uitgebreide incubatie keer kunnen ook leiden tot lysis van de buitensporige en dus verontreiniging van de breuk. Een redelijk compromis voor het bereiken van lysis van de efficiënte en relatief volledige buitenmembraan (behoud van het binnenste membraan) is 20 minuten incubatie over ijs in de buffer hypotone fractionering. Een andere overweging is de methode van extractie, harde extractie door schudden of vortex gevaar waar de kwaliteit van het extract zoals veroorzaakt aggregatie van eiwitten. Het is aanbevolen om het mengen zachtjes zoals door spatel, inversie of zuigen Pipetteer te handhaven van hoge kwaliteit materiaal voor downstream-analyse. Zuivering van preparatieve cel fractionering kan optreden met variabele efficiëntie, zoals blijkt uit Figuur 1. In één experiment, YfeA begon als 8% van het uitgepakte periplasmische gehalte (Figuur 1 c), terwijl in een ander experiment, YfeA begon als 17% van het periplasmische gehalte (Figuur 1 d). Deze verschillen kunnen voortvloeien uit verschillende redenen zoals variabele expressie omstandigheden (toevoegend EDTA tot de groei-media kan verhogen expressie van genen gereguleerd door honger mechanismen zoals bont regulering van de Yfe-promotor), herhaald gebruik van bevroren permanente voorraden, en menselijke fouten. In plaats van de incubatie tijden aan te passen, is het aanbevolen om schaalvergroting de voorbereiding. Zuivering uit het periplasma afvalfractie wordt aanbevolen om het opnemen van een lineaire gradiënt elutie uit de anion uitwisseling chromatografische stap. Een kleurovergang elutie van stap is een elutie strategie de toepassingen discrete en abrupte veranderingen in de samenstelling van de mobiele fase (dwz., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, enz.). Een lineaire gradiënt elutie is een elutie strategie die gebruikmaakt van geleidelijke verandering in de mobiele fase samenstelling (dat wil zeggen, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, enz.). Een stap-verloop is nuttig voor het scheiden van moleculen die verschillende affiniteiten voor de stationaire fase hebben, en een lineaire gradiënt elutie is handig voor het scheiden van moleculen die soortgelijke affiniteiten voor de stationaire fase hebben. In het geval van het zuiveren van eiwit met geen kunstmatige zuivering tag (om affiniteit voor de stationaire fase) van een cel compartiment die rijk is aan uniek eiwit soorten, wordt een lineaire gradiënt elutie aanbevolen aan afzonderlijke proteïnen van noninterest die hebben dezelfde affiniteiten met de stationaire fase als de proteïne van belang. In het algemeen, een rendement van 1-2 mg van gezuiverde apo YfeA verwachting uit elke liter cultuur uiten van YfeA van de endogene Y. pestis promotor.
Röntgen fluorescentie is een techniek waarmee de onderzoeker snel bepalen van metalen inhoud in een monster en de onderzoeker informeren over onverwachte metalen opname die anders onbekend zijn zou. Hoewel EDTA is opgenomen in de buffer van de hypertonic fractionering verwijderen losjes-geassocieerde of gratis metal, kan YfeA afgeleid van het periplasma breuk bevatten sommige holo-eiwit. Gezien het feit dat metalen vervoer een dynamisch proces is, misschien het eiwitgehalte holo afkomstig is van YfeA die zijn lading te YfeBCDE niet nog heeft gedoneerd. Het is vermeldenswaard dat X-ray fluorescentie alleen metalen totaalgehalte maatregelen en niet geeft als metaal is besteld in een kristalrooster, of specifiek aan een eiwit gebonden. Om te bepalen als metaal is besteld in een kristalrooster en/of specifiek aan een eiwit molecule gebonden, is X-ray scattering gegevensverzameling en -verwerking vereist. Echter zorgt Röntgen fluorescentie voor snelle monster beoordeling van metalen besmetting en/of residuele holo eiwit integratie. Synchrotronstraling tijd is beperkt en er is niet altijd tijd om een strategie uitstippelen voor het verzamelen van X-ray scattering gegevens op elke steekproef, Röntgen fluorescentie is dus een waardevolle techniek voor het screenen van vele kristallen en prioriteren welke monsters X-ray verstrooiing gegevens moeten worden verzameld. Röntgen fluorescentie maakt bovendien gegevensverzameling van monsters die kan niet de diffract van x-stralen. Terwijl de Röntgen fluorescentie gegevens verzamelt, soms het signaal kunnen zeer zwak en de resulterende spectra uninformative. Ter verbetering van de sterkte van het signaal, hetzij voor X-ray fluorescentie- of MAD scannen, kunt u de belichtingstijd te verhogen en/of minderen de X-ray beam demping. Wanneer een monster wordt geïdentificeerd voor X-ray scattering gegevens te verzamelen, is het raadzaam X-ray scattering gegevens te verzamelen over een ander deel van het monster dan wat werd gebruikt voor X-ray fluorescentie en MAD scannen naar het minimaliseren van de schade door straling, verbetering van de kwaliteit van de gegevens collectie, en minimaliseren van eventuele voor vermindering van abnormale signaal.
Detectie van radioactieve tracers vereist nanomolar hoeveelheden materiaal of minder, en het gebruik van deze verklikstoffen als gemachtigden van de moleculaire tracking biedt een eenvoudige en uiterst gevoelige methode van het sonderen van cellulaire processen. De bepaling van de radiometal hierboven beschreven kan worden gebruikt om te bepalen van de totale metalen opname, verdeling over cellulaire compartimenten, evenals de tarieven van de opname. Inderdaad, elk gegevenspunt tijd vereist een 40 minuten fractionering; zoals elk tijdstip is bereikt, zijn cellen echter onmiddellijk Ingehuld en geïncubeerd in hoge zout buffer (Figuur 5stap 1). Metingen van de Radiometal van de media, afgedankte hoog zout buffer (Figuur 5stap 1) en periplasmische en cytoplasmatische breuken na (Figuur 5stap 3) geven dat de hoge zout buffer incubatie met succes worden alle wijzigingen verwijderd overige niet-gekoppelde gratis metaal dat blijven na de initiële centrifugeren hangen na het bereiken van het punt van de tijd. De eerste centrifugeren wordt verwijderd meeste (tot wel 80%) van de niet-geassocieerde gratis metalen, alsmede het centrifugeren incubatie in de hoge zout buffer verwijdert ook extra resterende niet-gekoppelde vrije metaal. Aanhoudende bestandsnaamkoppeling gratis metalen zal naar verwachting aanzienlijk beïnvloeden metalen vervoer tijdens de fractionering 40 minuten. De invloed van de 40 minuten fractionering op intracellulair metalen transport is een andere overweging voor voorzichtige data interpretatie. Vrijwel het gehele fractionering protocol vindt plaats via ijs, afgezien van de 30 tweede centrifugeren tussen stappen. Metalen transporttijd cursus experimenten hebben aangegeven dat het behoud van de cellen bij 4 ° C metalen vervoer20,21,22 intrekt; Daarom, omdat de experimenten plaatsvindt over ijs, de 40 minuten fractionering is naar verwachting niet metalen niveaus in het periplasma van cytoplasma aanzienlijk te vergroten en de metalen niveaus moeten representatief zijn voor de tijdstippen waarop de cellen werden in eerste instantie centrifugalized.
Bepaling van de relatieve opname in andere cellulaire compartimenten kan helpen XFS gegevens informeren, bevestigen de fysiologische aard van een substraat, alsook inschakelen van de onderzoeker om verdere sonde de moleculaire details van een mechanisme. Bijvoorbeeld, toevoeging van genetische mutagenese radiometal opname experimenten biedt een directe methode ter versterking van de belangrijkste functionele residuen of moleculen betrokken bij substraat vervoer. Voordelen van radiometal opname experimenten en analyses zijn snelle turnaround, hoge doorvoer, hoge reproduceerbaarheid en paralellisatie van experimenten vergelijken groei omstandigheden en genetische constructies.
The authors have nothing to disclose.
Ook werden gegevens verzameld op GM/CA@APS, die geheel of gedeeltelijk met federale fondsen van het National Cancer Institute (ACB-12002) en het National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006) werd gefinancierd. Dit onderzoek gebruikte bronnen van de geavanceerde Photon bron (APS), een Amerikaanse Department of Energy (DOE) Office van wetenschap gebruiker faciliteit geëxploiteerd voor de DAMHINDE Office of Science door Argonne National Laboratory onder Contract nr. DE-AC02-06CH11357. Gebruik van de geavanceerde Photon bron werd gesteund door de U. S. Department of Energy, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, onder het veld Contractnr. W-31-109-Eng-38.
Wij willen erkennen de UAB uitgebreide Cancer Center – massa spectrometrie/Proteomics gedeeld faciliteit (P30CA13148-38) voor hun hulp bij de analyse van de Spectrometrie van de massa.
C.D.R. werd gesteund door een subsidie van de Universiteit van Alabama in Birmingham Office van diversiteit, eigen vermogen, en integratie. L.L.R. werd gesteund door de dienst radiologie van de Universiteit van Alabama in Birmingham. Het Department of Energy, Office of Science, Isotope programma ondersteund 52Mn productie en A.V.F.M. onder verlenen DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |