Размер имеет значение: Измерение диаметра капсулы в Cryptococcus neoformans
Summary
Полисахаридной капсулы является фактором первичного вирулентности Cryptococcus neoformans, и его размер коррелирует с вирулентности штамма. Капсула диаметр измерения используются в фенотипических тестирования и оценки терапевтической эффективности. Здесь представлен стандартный метод капсула индукции, и сравниваются два методы окрашивания и измерения диаметра.
Abstract
Полисахаридной капсулы Cryptococcus neoformans является фактором первичного вирулентности и один из самых часто изучал аспекты этой патогенных дрожжей. Капсула размер может широко варьироваться между штаммами, обладает способностью быстро расти, когда стресс или низкой питательных условий и был положительно коррелирует с вирулентности штамма. По этим причинам размер капсулы представляет большой интерес для исследователей, C. neoformans . Рост C. neoformans капсула индуцируется во время тестирования фенотипические чтобы помочь понять последствия различных методов лечения на дрожжи или размер различия между штаммами. Здесь мы описываем один из стандартных методов капсула индукции и сравнить два признанных методов окрашивания и измерительная капсула диаметр: (i) чернила Индии, отрицательные пятно, используется в сочетании с обычными светлую микроскопию и (ii) совместно окрашивание с Краски люминесцентные, флуоресцентные клеточной стенки и капсула, следуют confocal микроскопии. Наконец, мы покажем, как измерение капсул диаметром от окрашенных чернил Индии образцы могут быть автоматизированы с помощью анализа вычислительных изображений.
Introduction
Влияющих на четверть миллиона человек каждый год и в результате более чем 180 000 смертей ежегодно, Cryptococcus neoformans является патогенным, внутриклеточный дрожжей и возбудителя криптококкоза1,2, 3. наибольшей являются ВИЧ позитивных пациентов в бедных странах, которые не имеют доступ к антиретровирусной терапии, что делает их крайне восприимчивы к болезни4,5,6. Данные из CDC показывают, что в Африке к югу от Сахары, C. neoformans убивает больше людей, чем туберкулеза, ежегодно и более каждый месяц, чем любой вспышки лихорадки Эбола на запись1. Наиболее распространенные пути воздействия происходит от вдыхания сморщившимися споры, которые являются обычным явлением в среду7. При входе в легкие, существует несколько факторов вирулентности, которые внести вклад в успех C. neoformans в инфицированных лиц. Полисахаридной капсулы считается фактором первичного вирулентности микроба, acapsular штаммы являются не вирулентные8.
Криптококковый капсула состоит из трех компонентов принцип: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) и mannoproteins (MPs)9. Хотя м/с являются относительно незначительными клеточной стенки связанный компонент капсулы, они иммуногенность и может способствовать в основном про воспалительной реакции9,10. В отличие от GXM и GalXM составляют основную часть капсулы (> 90% по весу) и иммуносупрессивные последствия11. В дополнение к его иммуномодулирующие эффекты быстрое расширение капсулы в естественных условиях создает механический барьер для употребления, принимающих фагоцитирующих клеток (то есть, нейтрофилы и макрофаги)12. C. neoformans капсулу и его синтеза являются сложными, но в целом, увеличение диаметра капсулы коррелирует с повышенной вирулентности6,,1314. Учитывая это, важно для C. neoformans исследователей иметь возможность быстро и точно подсчитать капсула измерений.
C. neoformans ячейки и ее полисахаридной капсулы являются динамические структуры и показать изменения за время15. Капсулы можно изменить плотность, размер и Ассамблея в ответ на изменения в принимающей среде16,17,18. Инициировать капсулы рост16,18,,1920известны низкой железа или уровни питательных веществ, воздействие сыворотки, человеческого физиологических рН и увеличение CO2 . Кроме того исследователи показали структурные изменения, что привело к значительным различиям в иммунореактивности во время инфекции, кредитование преимущество C. neoformans над его пребывания21,22. Это известно, потому что архитектура C. neoformans капсулы были проанализированы в различных способами. Электронная микроскопия, например, показал, что капсула имеет гетерогенной матрицы с электронно плотные внутренний слой под более проницаемым слоем23. Рассеяние света и использование Оптический пинцет позволили исследователям для дальнейшего выяснения его макромолекулярных свойства24. Анализируя результаты из обоих измерений статического и динамического рассеяния света, мы знаем, что полисахарид капсулы имеет сложной разветвленной структуры23. Оптический пинцет были использованы для тестирования жесткость структуры, а также оценить его антитела реактивности24. Однако на сегодняшний день наиболее часто занятых анализ C. neoformans капсулы является измерение его размер.
Для количественного определения размера капсулы, исследователи используют, что должно быть простой измерения: линейный диаметр капсулы. Цифровые микроскопы, используются для захвата изображения нескольких C. neoformans клеток (как правило сотни) окрашенных чернил Индии или флуоресцентными красителями. Размер каждой клетки тела и окружающего капсулы измеряется. Данные компилируются, и средний диаметр капсулы рассчитывается путем вычитания клетки тела диаметром от диаметра всей клетки (клетки тела + капсула). До этого момента эти измерения были сделаны вручную. Хотя в целом точной, этот метод имеет недостатки для исследователей. Большие наборы данных может занять дни или даже недели, чтобы анализировать вручную. И потому, что эти измерения выполняются вручную, субъективности и человеческой ошибки могут повлиять на результат.
Анализ автоматизированной вычислительной изображений стал незаменимым инструментом для исследователей во многих областях молекулярной клеточной биологии, позволяя более быстрый и надежный анализ биологических изображения 25,,2627. Методы анализа точных изображений необходимо добывать количественную информацию от того, что часто сложных и огромных наборов данных. Однако некоторые измерения, особенно измерения C. neoformans капсула, были трудно автоматизировать. Точно определить интерфейс между клеточной стенки и капсула, которая обычно появляется как кольцо тьмы, когда imaged при фазово контрастной микроскопии, может быть хлопотно для разрешения с помощью простой порог. Кроме того C. neoformans клеток в культуре, как правило, слипаются и точная сегментация клеток необходима для точных измерений.
Цель этого проекта заключалась в (i) иллюстрируют один из стандартных протоколов для капсула индукции в C. neoformans, (ii) сравнить и сопоставить чернил Индии и флуоресценции окрашивание как они относятся к капсуле диаметром измерения, (iii) разработка простой, вычислительные методы для измерения капсул диаметром, с использованием изображений чернил Индии, окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений и, (iv) оценить преимущества и ограничения измерения диаметра капсулы вручную и с помощью программного обеспечения автоматизации. Мы обнаружить, что из двух пятная методов, люминесцентные маркировки клеточной стенки и капсула, пока больше времени при условии наиболее последовательных результатов между экспериментов. Однако, оба метода позволило нам успешно проводить различие между лаборатории и клинической C. neoformans экспонируется различных штаммов капсулы размеров. Кроме того мы смогли автоматизировать измерения капсул диаметром от чернил Индии, окрашенные образы и обнаружил, что это была жизнеспособной альтернативой ручного измерения капсулы.
Protocol
Representative Results
Discussion
На протяжении десятилетий капсулы был одним из основных направлений исследований для микологи и клиницисты заинтересованы в C. neoformans и криптококкоз из-за его роль как фактор основных вирулентности возбудителя. С помощью микроскопии для измерения размера капсулы различия штаммов …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Департамент биологии и молекулярной бионаукам (MOBI) докторской программы в середине университета штата Теннесси (MTSU) за предоставление финансирования для этого исследования. Проект также был частично финансируется Фондом MTSU гранта в специальных проектов для д.э.н..
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
