Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans
Summary
La capsule de polysaccharide est le facteur de virulence primaire à Cryptococcus neoformans, et sa taille est corrélé avec la virulence de la souche. Mesures de diamètre capsule sont utilisées dans les tests phénotypiques et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Une méthode standard d’induction capsule est présentée ici, et on a comparé deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre.
Abstract
La capsule de polysaccharide de Cryptococcus neoformans est le facteur de virulence primaire et un des plus couramment étudié les aspects de cette levure pathogène. Taille de la capsule peut varier considérablement entre les souches, a la capacité de croître rapidement lorsque vorstellen conditions nutritives stressantes ou faibles et a été positivement corrélée avec la virulence de la souche. Pour ces raisons, la taille de la capsule est d’un grand intérêt pour les chercheurs de c. neoformans . La croissance de la capsule de c. neoformans est induite pendant le test phénotypique pour aider à comprendre les effets des différents traitements sur les différences de levure ou de taille entre les souches. Nous décrivons ici une des méthodes standards de capsule induction et comparer deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre de la capsule : (i) de l’encre de Chine, un colorant négatif, utilisé en conjonction avec la microscopie optique conventionnelle et (ii) coloration conjointement avec colorants fluorescents de la paroi cellulaire et capsule suivie par microscopie confocale. Enfin, nous montrons comment la mesure du diamètre capsule des échantillons colorés à l’encre de Chine peut être automatisé en utilisant l’analyse de l’image numérique.
Introduction
Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose1,2, 3. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne, c. neoformans tue plus de personnes que la tuberculose chaque année et plus chaque mois à une épidémie d’Ebola sur record1. La voie d’exposition la plus courante se produit à l’inhalation de spores desséchés qui sont monnaie courante dans l’ environnement7. En entrant dans les poumons, il y a plusieurs facteurs de virulence qui contribuent au succès de c. neoformans chez les individus infectés. La capsule polysaccharidique est considérée comme facteur de virulence primaire de microbe, que capsulée souches non virulentes8.
La capsule cryptococcique se compose de trois éléments de principe : glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) et mannoprotéines (MPs)9. Alors que les députés sont une composante relativement mineure d’associée à la paroi cellulaire de la capsule, ils sont immunogènes et peuvent favoriser une réponse essentiellement pro-inflammatoire9,10. En revanche, les GXM et GalXM forment l’essentiel de la capsule (> 90 % en poids) et ont des effets immunosuppressifs11. Outre ses effets immunomodulateurs, l’élargissement rapide de la capsule en vivo crée une barrière mécanique à l’ingestion par l’hôte des cellules phagocytaires (c.-à-d., des neutrophiles et macrophages)12. La capsule de c. neoformans et sa synthèse sont complexes, mais dans l’ensemble, une augmentation de diamètre capsule est corrélée avec une virulence accrue de13,6,14. Ceci étant, il est important pour les chercheurs de c. neoformans pouvoir rapidement et précisément quantifier les mesures capsules.
La cellule c. neoformans tant sa capsule de polysaccharide sont des structures dynamiques et montrent des changements au fil du temps15. La capsule peut changer dans la densité, la taille et l’Assemblée en réponse aux changements dans l’hôte environnement16,17,18. Faible teneur en fer ou niveaux d’éléments nutritifs, exposition au sérum, le pH physiologique humain et une augmentation du CO2 sont connus pour ouvrir la capsule croissance16,18,19,20. En outre, les chercheurs ont montré des changements structurels, ce qui entraîne des différences significatives dans l’immunoréactivité lors d’une infection, prêt un avantage à c. neoformans sur son hôte21,22. Ceci est connu parce que l’architecture de la capsule de c. neoformans a été analysée dans une variété de façons. Microscopie électronique, par exemple, a révélé que la capsule a une matrice hétérogène avec une couche interne dense aux électrons sous une couche extérieure, plus perméable23. Diffusion de la lumière et l’utilisation de pinces optiques ont permis aux chercheurs d’élucider davantage ses propriétés macromoléculaires24. Analyse des résultats de ces deux mesures de diffusion de la lumière statique et dynamique, nous savons que la capsule polyosidique a un complexe de la structure ramification23. Des pinces optiques ont été utilisés pour tester la rigidité de la structure mais aussi à évaluer son anticorps réactivité24. Cependant, l’analyse de loin le plus souvent indépendants de la capsule de c. neoformans est la mesure de sa taille.
Afin de quantifier la taille de la capsule, les chercheurs utilisent ce que devrait être une mesure simple : le diamètre linéaire de la capsule. Microscopes numériques sont utilisées pour capturer des images de plusieurs cellules de c. neoformans (généralement des centaines) colorés avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents. La taille de chaque corps cellulaire et de la capsule environnante est mesurée. Les données sont compilées, et le diamètre moyen de la capsule est calculé en soustrayant le diamètre du corps cellulaire du diamètre à germes entiers (corps cellulaire + capsule). Jusqu’à présent, ces mesures ont été faites manuellement. Bien que généralement exacte, cette méthode a des inconvénients pour les chercheurs. Ensembles de données volumineux peut prendre des jours ou même des semaines pour analyser à la main. Et parce que ces mesures sont effectuées manuellement, la subjectivité et l’erreur humaine peuvent affecter le résultat.
Analyse d’image informatique automatisé est devenu un outil indispensable pour les chercheurs dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire, permettant une analyse plus rapide et plus fiable des images biologiques 25,26,27. Techniques d’analyse précise de l’image sont nécessaires pour extraire des informations quantitatives de ce qui sont souvent des ensembles de données complexes et immenses. Toutefois, certaines mesures, notamment la mesure de la capsule de c. neoformans , été difficiles à automatiser. Identifier avec précision l’interface entre la paroi cellulaire et de la capsule, qui apparaît généralement comme un anneau sombre lorsqu’imagée par microscopie à contraste de phase, peut être gênante résoudre à l’aide d’un simple seuil. En outre, les cellules en culture de c. neoformans ont tendance à s’agglomérer et segmentation précise des cellules est nécessaire pour des mesures précises.
Ce projet vise à (i) illustrent un des protocoles standards pour capsule induction dans c. neoformans, (ii) comparer et contraster l’encre de Chine et coloration de fluorescence en ce qui concerne pour capsule mesures de diamètre, (iii) développer simple, méthodes de calcul pour mesurer le diamètre capsule à l’aide d’images d’encre teinté de cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse image et, (iv) évaluent les avantages et les limites de mesure diamètre capsule manuellement et à l’aide d’automation de logiciel. Nous conclure que les deux méthodes de coloration, fluorescent d’étiquetage de la paroi cellulaire et de la capsule, alors que plus de temps, a fourni les résultats les plus cohérents entre les expériences. Toutefois, les deux méthodes nous a permis de distinguer avec succès entre le laboratoire et clinique c. neoformans souches présentant différents capsule tailles. En outre, nous avons pu automatiser la mesure du diamètre capsule de l’encre de Chine coloré des images et trouvé que c’était une alternative viable à la mesure manuelle de la capsule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pendant des décennies, la capsule a été un élément majeur de la recherche pour les mycologues et les cliniciens intéressés par c. neoformans et cryptococcose en raison de son rôle comme un facteur de virulence important pour l’agent pathogène. En utilisant la microscopie à mesurer les différences dans la taille de la capsule entre les souches et en vertu de la croissance de différente conditions peuvent fournir des informations importantes concernant l’agent pathogène et ses réponses aux divers…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le programme doctoral de Biosciences moléculaires (MOBI) et le département de biologie à Middle Tennessee State University (MTSU) pour assurer le financement de cette étude. Le projet est également financé en partie par une subvention de projets spéciaux à recevoir par la Fondation MTSU.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
