Size Matters: Måling av kapselen Diameter i Cryptococcus neoformans
Summary
Polysakkarid kapsel er primære virulens faktor i Cryptococcus neoformans, størrelsen korrelerer med belastning virulens. Kapsel diameter målinger brukes i fenotypiske testing og å måle terapeutiske effekten. Her en standardmetode for kapsel induksjon er presentert, og to metoder for flekker og måle diameter sammenlignes.
Abstract
Polysakkarid kapsel av Cryptococcus neoformans er primære virulens faktor og en av mest studerte vanlige aspekter av dette patogene gjær. Kapsel størrelse varierer mellom stammer, evnen til å vokse raskt når introdusert belastende eller lavt næringsinnhold forhold og har blitt positivt korrelert med belastning virulens. For disse grunner er størrelsen på kapselen av stor interesse for C. neoformans forskere. Veksten av C. neoformans kapselen er indusert under fenotypiske testing til å forstå effekten av ulike behandlinger på gjær eller størrelsen forskjellen stammer. Her beskriver vi en av standardmetodene kapsel induksjon og sammenligne to akseptert metoder for flekker og måle kapsel diameter: (i) tusj, en negativ flekken, brukes i forbindelse med konvensjonelle * lys og (ii) co-farging med fluorescerende fargestoffer i både cellevegg og kapsel etterfulgt av AC confocal mikroskopi. Endelig vi viser hvordan måling av kapselen diameter fra India blekk-beiset prøver kan automatisert benytter beregningsorientert bildeanalyser.
Introduction
Påvirker en kvart million mennesker hvert år, og resulterer i mer enn 180.000 dødsfall årlig er Cryptococcus neoformans en sykdomsfremkallende, intracellulær gjær og den utløsende agenten for cryptococcosis1,2, 3. hardest rammet er HIV-positive pasienter i fattige land som ikke har tilgang til antiretroviral behandling, noe som gjør dem akutt utsatt for sykdom4,5,6. Data fra CDC indikerer at i Sahara, C. neoformans dreper flere mennesker enn tuberkulose årlig og mer hver måned enn noen Ebola utbrudd på post1. Den vanligste ruten eksponering oppstår fra inhaling desiccated spores som er vanlig i miljøet7. Når du kommer inn i lungene, finnes det flere virulens faktorer som bidrar til suksess for C. neoformans i infiserte individer. Polysakkarid kapsel anses den mikrobe primære virulens faktor, som acapsular stammer ikke virulente8.
Cryptococcal kapselen består av tre prinsippet komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), og mannoproteins (MPs)9. Mens MPs er en relativt mindre celleveggen-assosiert komponent av kapselen, de er immunogenic og kan fremme en mest pro-inflammatorisk respons9,10. I kontrast, GXM og GalXM utgjør hoveddelen av kapselen (> 90% av vekten) og har suppressive effekter11. I tillegg til sin immunmodulerende effekter skaper raske utvidelsen av kapselen i vivo en mekanisk barriere til inntak av verten phagocytic celler (dvs., nøytrofile og makrofager)12. C. neoformans kapsel og syntese dens er kompleks, men samlet, økt kapsel diameter er korrelert med økt virulens6,13,14. Gitt dette, er det viktig for C. neoformans forskere å raskt og nøyaktig kvantifisere kapsel målinger.
Både C. neoformans cellen og dens polysakkarid kapsel er dynamiske strukturer og vise endringer over tid15. Kapselen kan endre tetthet, størrelse og montering i respons på endringer i vert miljøet16,17,18. Lav jern eller nivåer av næringsstoffer, eksponering for serum, menneskets Fysiologiske pH og økt CO2 er kjent for å starte kapsel vekst16,18,19,20. Videre, har forskere vist strukturelle endringer som fører til betydelige forskjeller i immunoreactivity under en infeksjon, utlån en fordel å C. neoformans over vertsstasjonen21,22. Dette er kjent fordi arkitektur C. neoformans kapselen er analysert i en rekke måter. Elektronmikroskop, for eksempel har avdekket at kapselen har en heterogen matrise med en indre elektron-tette laget under en ytre, mer gjennomtrengelig lag23. Lysspredning og bruk av optiske pinsett har tillatt forskere å ytterligere belyse sin macromolecular egenskaper24. Analysere resultatene fra både statiske og dynamiske lysspredning målinger, vet vi at polysakkarid kapsel har en kompleks forgrening struktur23. Optisk pinsett har blitt brukt til å teste stivhet av strukturen samt vurdere sin antistoff reaktivitet24. Men er langt den mest næringsdrivende analyse av C. neoformans kapselen måling av størrelsen.
For å kvantifisere kapsel størrelse, forskere bruke hva som bør være en enkel måling: lineær diameteren på kapselen. Digital mikroskop brukes til å ta bilder av flere C. neoformans celler (vanligvis hundrevis) med blekk eller fluorescerende fargestoffer. Størrelsen på hver celle kroppen og omkringliggende kapsel måles. Dataene er hentet, og gjennomsnittlig diameter på kapselen beregnes ved å trekke fra celle kroppen diameter fra hele cellen diameter (celle kroppen + kapsel). Frem til dette punktet, har disse målingene gjort manuelt. Mens generelt nøyaktig, har denne metoden ulemper for forskere. Datasett kan ta dager eller uker å analysere for hånd. Og fordi disse mål gjøres manuelt, subjektivitet og menneskelig feil kan påvirke resultatet.
Automatisert beregningsorientert bildeanalyser har blitt et uunnværlig verktøy for forskere i mange områder av molekylære cellebiologi, muliggjør raskere og mer pålitelig analyse av biologiske bilder 25,26,27. Nøyaktig bilde analyseteknikker er nødvendig til mine kvantitativ informasjon fra det som ofte kompleks og enorme datasett. Men har noen målinger, spesielt måling av C. neoformans capsule, vært vanskelig å automatisere. Nøyaktig identifiserer grensesnittet mellom cellen vegg og kapsel, som vanligvis vises som en mørk ring når fotografert av kontrast mikroskopi, kan være plagsom å løse ved hjelp av en enkel terskel. Videre C. neoformans celler i kultur tendens til å klumpe seg sammen og nøyaktig segmentering av cellene er nødvendig for nøyaktige målinger.
Målet med dette prosjektet var å (i) illustrere en av standardprotokoller for kapsel induksjon i C. neoformans, (ii) Sammenlign og kontrast tusj og fluorescens flekker som de hører for å kapsel diameter målinger, (iii) utvikle enkel, beregningsorientert metoder for å måle kapsel diameter med bilder av blekk for farget celler ved hjelp av en analyseprogramvare, og, (iv) vurdere fordelene og begrensningene for måling kapsel diameter manuelt og automatisering programvare. Vi finner at av to flekker metoder, fluorescerende merking av celle veggen og kapsel, mens mer tidkrevende, gitt de mest konsekvente resultatene mellom eksperimenter. Men begge metodene mulig for oss å kunne skille mellom lab og klinisk C. neoformans stammene viser forskjellige kapsel størrelser. Videre, vi var i stand til å automatisere måling av kapselen diameter fra India blekk farget bilder og funnet at dette var et levedyktig alternativ til manuell måling av kapselen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I flere tiår, har kapsel vært fokus for forskning både mycologists og klinikere interessert i C. neoformans og cryptococcosis på grunn av sin rolle som en stor virulens faktor for patogen. Bruke mikroskopi å måle forskjellene i kapselen størrelse stammer og under forskjellige vekst forhold kan gi viktig informasjon om patogen og svarene på ulike stimuli (dvs., ulike miljøforhold, potensielle medikamentelle behandlinger, etc.) her har vi skissert en metode for å indusere veksten av kap…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker molekylær biovitenskap (MOBI) doktorgrad programmet og biologi avdeling på Middle Tennessee State University (MTSU) for å gi midler til denne studien. Prosjektet ble også finansiert delvis av spesielle prosjekter stipend tildeles D.E.N. av MTSU Foundation.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
