Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans
Summary
La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.
Abstract
La cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans es el factor de virulencia principal y uno de los más comúnmente estudiados aspectos de esta levadura patógena. Tamaño de la cápsula puede variar ampliamente entre cepas, tiene la capacidad de crecer rápidamente cuando introdujo a estrés o bajo condiciones de nutrientes y se ha correlacionado positivamente con la virulencia de la cepa. Por estas razones, el tamaño de la cápsula es de gran interés para los investigadores de C. neoformans . El crecimiento de la cápsula de C. neoformans es inducido durante la prueba fenotípica para ayudar a comprender los efectos de diferentes tratamientos sobre las diferencias entre cepas de levadura o el tamaño. Aquí describimos uno de los métodos estándar de cápsula inducción y comparar dos métodos aceptados de coloración y diámetro de la cápsula de medición: tinta de la India (i), una tinción negativa, utilizado conjuntamente con microscopía óptica convencional y (ii) Co la coloración con tintes fluorescentes de la pared celular y cápsula seguido por microscopia confocal. Por último, os mostramos cómo medida de diámetro cápsula de muestras manchadas de tinta de la India puede ser automatizado usando análisis de imagen Computacional.
Introduction
Afectando a un cuarto de millón de personas cada año y resultando en más de 180.000 muertes al año, Cryptococcus neoformans es una levadura patógena, intracelular y el agente causante de la criptococosis1,2, 3. más afectados son los pacientes VIH-positivos en los países pobres que no tienen acceso a tratamiento antirretroviral, lo que los hace muy susceptibles a la enfermedad4,5,6. Datos de los CDC indican que en el África subsahariana, C. neoformans mata más personas que la tuberculosis anualmente más cada mes y que cualquier brote de Ébola en el registro1. La vía más común de exposición ocurre por inhalación de esporas desecadas que son comunes en el medio ambiente7. Al entrar en los pulmones, hay varios factores de virulencia que contribuyen al éxito de C. neoformans en los individuos infectados. La cápsula de polisacárido se considera factor de virulencia principal del microbio, como acapsular cepas no virulentas8.
La cápsula de Cryptococcus se compone de tres componentes del principio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) y manoproteínas (MPs)9. Mientras que los diputados son un componente relativamente de menor importancia asociada a la pared celular de la cápsula, son inmunogénicos y pueden promover una respuesta sobre todo pro-inflamatoria9,10. Por el contrario, GXM y GalXM conforman la mayor parte de la cápsula (> 90% en peso) y tienen efectos inmunosupresores11. Además de sus efectos inmunomoduladores, la ampliación rápida de la cápsula en vivo crea una barrera mecánica a la ingestión por las células fagocíticas (es decir, neutrófilos y macrófagos) del anfitrión12. La cápsula de C. neoformans y la síntesis son complejas, pero en general, mayor diámetro cápsula se correlaciona con mayor virulencia6,13,14. Ante esto, es importante para los investigadores de C. neoformans ser capaces de forma rápida y precisa cuantificar las mediciones de la cápsulas.
Las células de C. neoformans y su cápsula de polisacáridos son estructuras dinámicas y muestran cambios en tiempo15. La cápsula puede cambiar en densidad, tamaño y montaje en respuesta a cambios en el entorno de host16,17,18. Hierro bajo o los niveles de nutrientes, exposición al suero, el pH fisiológico humano y aumento de CO2 se saben que iniciar crecimiento cápsula16,18,19,20. Además, los investigadores han demostrado cambios estructurales dando como resultado diferencias significativas en el immunoreactivity durante una infección, una ventaja a C. neoformans sobre su huésped los préstamos21,22. Esto se conoce porque la arquitectura de la cápsula de C. neoformans ha sido analizada en una variedad de maneras. Por ejemplo, microscopía electrónica, ha revelado que la cápsula tiene una matriz heterogénea con una capa interna de electrón-densos debajo de una capa externa, más permeable23. Dispersión de la luz y el uso de pinzas ópticas han permitido a los investigadores aclarar más lejos sus características macromoleculares24. Analizar los resultados de ambas mediciones de la dispersión ligera estática y dinámica, sabemos que la cápsula de polisacárido tiene una compleja ramificación de la estructura23. Pinza óptica se han utilizado para probar la rigidez de la estructura así como evaluar su reactividad anticuerpo del24. Sin embargo, el más frecuentemente empleado análisis de la cápsula de C. neoformans es la medida de su tamaño.
Para cuantificar el tamaño de la cápsula, los investigadores utilizan lo que debería ser una medida simple: el diámetro lineal de la cápsula. Microscopios digitales se utilizan para capturar imágenes de múltiples células de C. neoformans (generalmente cientos) teñidos con tinta china o con colorantes fluorescentes. Se mide el tamaño de cada cuerpo celular y la cápsula circundante. Los datos son compilados, y el diámetro medio de la cápsula se calcula restando el diámetro del cuerpo de la célula del diámetro entero de la célula (célula corporal + cápsulas). Hasta este punto, estas mediciones se han realizado manualmente. Mientras que generalmente precisa, este método tiene inconvenientes para los investigadores. Conjuntos de datos grandes puede tomar días o incluso semanas para analizar con la mano. Y ya que estas mediciones se hacen manualmente, subjetividad y el error humano pueden afectar el resultado.
Análisis de imagen Computacional automatizado se ha convertido en una herramienta indispensable para los investigadores en muchas áreas de la biología molecular de la célula, lo que posibilita un análisis más rápido y más fiable de imágenes biológicas 25,26,27. Técnicas de análisis de imágenes precisos son necesarias para extraer información cuantitativa de lo que a menudo son complejos e inmensos conjuntos de datos. Sin embargo, algunas medidas, especialmente la medición de la cápsula de C. neoformans , han sido difíciles de automatizar. Identificar con precisión la interfaz entre la pared celular y cápsula, que generalmente aparece como un anillo oscuro cuando imágenes por microscopia de contraste de fase, puede ser problemática a resolver mediante un simple umbral. Además, las células de C. neoformans en cultivo tienden a agruparse y precisa segmentación de las células es necesario para las medidas exactas.
El objetivo de este proyecto fue para (i) ilustrar uno de los protocolos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans, (ii) Comparar y contrastar la tinta India y tinción de fluorescencia relativas para mediciones del diámetro de la cápsula (iii) desarrollar simple, métodos computacionales para medir diámetro cápsula utilizando imágenes de tinta de la India manchadas las células usando un software de análisis de imagen y, (iv) evaluación los beneficios y limitaciones de diámetro de la cápsula de medición manualmente y utilizando la automatización del software. Encontramos que de los dos métodos de tinción, fluorescentes de la pared celular y cápsula, mientras más desperdiciadores de tiempo, proporciona los resultados más consistentes entre experimentos. Sin embargo, ambos métodos nos permitieron distinguir correctamente entre laboratorio y clínica C. neoformans exhibe diferentes cepas cápsula tamaños. Además, fuimos capaces de automatizar la medición de diámetro cápsula de tinta manchada imágenes y encontró que ésta era una alternativa viable para medición manual de la cápsula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante décadas, la cápsula ha sido un importante foco de investigación para micólogos y médicos interesados en C. neoformans y criptococosis debido a su papel como factor de virulencia importante para el patógeno. Mediante microscopía para medir diferencias en el tamaño de la cápsula entre cepas y bajo crecimiento diferentes condiciones pueden proporcionar información importante sobre el patógeno y sus respuestas a varios estímulos(es decir, diferentes condiciones ambientales, posibles trat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al programa de doctorado de biociencias moleculares (MOBI) y el Departamento de biología en Tennessee medio estado Universidad (MTSU) para proporcionar el financiamiento para este estudio. El proyecto también fue financiado en parte por una subvención de proyectos especial concedida al D.E.N. de la Fundación de MTSU.
Materials
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
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