洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出
Summary
洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4 グルコース輸送体タンパク質の最初の内腔のループに結合を用いた膜タンパク質相互作用の検出のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
蛋白質蛋白質の相互作用を探索する我々 の能力は、セル内の規制の接続を理解する鍵です。ただし、多くの場合タンパク質-タンパク質相互作用の検出は、重要な実験課題に関連付けられます。特に、並べ替えの受容体は、これらの蛋白質の免疫沈降の co を使用できなくなり、洗剤に敏感なファッション多いの膜区画のルーメン内タンパク質貨物と対話します。グルコーストランスポーター GLUT4 を膜タンパク質相互作用弱い内腔の例として役立つことを並べ替えの受容体ソーティリンの結合。ここでは、ソーティリンと GLUT4 の相互作用を検証するための高速、シンプル、かつ安価な試金を記述します。そのため設計し、GLUT4 の内腔の一部の潜在的なソーティリン-結合エピトープに対応する myc タグ付きペプチドを化学合成した.6 ヒスチジンが付いたソーティリンは、哺乳類細胞で発現され、コバルト ビーズを用いたセル lysates から分離されました。ビーズに固定化したソーティリンが異なる pH 値でペプチド溶液で培養された、溶出の材料は西部にしみが付くことによって分析しました。この試金は簡単に他の洗剤に敏感なタンパク質間相互作用の研究に適応することができます。
Introduction
GLUT4 はそれが食後血ブドウ糖クリアランス1インスリンの効果を仲介する脂肪と骨格筋細胞に主に発現するグルコース輸送タンパク質です。非常に安定したタンパク質であること、GLUT4 は翻訳後修飾レベルで調整されます。インスリンのない場合は、GLUT4 は、主細胞膜 (それゆえ低グルコースの基底透水性) から除外され、主に小さなインスリン応答性小胞 (IRVs) の細胞内局在とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) を表す可能性があります。IRV ドナー コンパートメントです。インスリン投与時に、IRVs は細胞膜と融合し、その機能のサイトに GLUT4 を提供します。脂肪細胞、骨格筋細胞に血液からブドウ糖取り込み上昇する 10 倍、これはグルコースの細胞膜の透過性を増加します。インスリン離脱後 GLUT4 は並べ替えと初期エンドソームに取り込ま、TGN、IRVs、再結成に取得されます。両方の並べ替え手順 GLUT4 経路、すなわち末梢早期エンドソームから核 TGN に取得し、IRVs の形成の TGN ドナーの Vps10p 家族のメンバー、ソーティリンは、型を表しますで膜が有効 I膜貫通型タンパク質と並べ替えの受容体。1 つのモデルによるとソーティリンは、膜貫通足場蛋白質として働く: それはエンドソームと TGN の内腔の GLUT4 を連結して、その C 末端の2、 、ドナー膜を介して細胞質側にレトロマーやクラスリン アダプターを募集3。 これは容易に細胞内コンパートメント間 GLUT4 を若し小胞のキャリアへの GLUT4 の分配。
ソーティリンの細胞質テール レトロマーとさまざまなアダプター蛋白質との相互作用はよく記載されています。ただし、ソーティリン GLUT4 (とその他のタンパク質のリガンドのいくつか) のバインドに証明するためにチャレンジしております。特に、co immunoprecipitate ソーティリンと GLUT4 の試みこれらの 2 つの蛋白質間の相互作用の洗剤に敏感な性質のためにおそらく成功されていません。また、典型的な輸送体タンパク質 GLUT4 が 12 の膜貫通ドメインと六つの内腔ループの組み合わせはソーティリン結合部位を表すことができる可能性があります。同時に酵母 2 ハイブリッド系の架橋膜透過性の DSP との相互作用のセルで、実質的なの共局在などの間接証拠の大きいボディは、そのソーティリンは GLUT4 にバインドすることをお勧めします。さらに、変異をスキャン アラニンと組み合わせで後者のアプローチを使用して、以前決定した GLUT4 の最初の内腔のループに主にソーティリンの Vps10p ドメインがバインドされていること。しかし、哺乳類細胞でこのような相互作用の証拠が行方不明になっています。ここでは、酸性の環境でのようなソーティリン コバルト樹脂を使用し、pH 6 および 8 の pH で GLUT4 の最初の内腔ループに対応する化学的に合成されたペプチドがやり取りできることを示した transfected 3t3-l1 細胞からの彼の付けられた分離した、エンドソーム内腔と TGN 膜の内腔で中立的な環境。同じビーズで非トランスフェクト細胞から調製した抽出物を読み込んだ制御実験のペプチド結合が見つかりませんでした。
Protocol
Representative Results
Discussion
ソーティリンは両方のシグナル伝達の細胞膜と細胞内の並べ替えイベント6,7に関連する進化的保存されている複数のリガンド蛋白質受容体です。ただし、本格的なソーティリン配位子 (一部が内腔や不可欠な膜蛋白質) の検索は、その結合パートナーのいくつかとソーティリンの相互作用が洗剤に敏感であるように複雑です。したがって、簡単およ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DK52057 と K.V.K. X.P に NIH から DK107498 は、NIH からの研修制度の助成金 2T32DK007201 によって支えられた研究補助金によって支えられました。
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
