Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner
Summary
Vi beskriver en protokoll for påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner med binding av sortering reseptoren, sortilin, til første luminal sløyfen glukose transporter protein, GLUT4, som eksempel.
Abstract
Vår evne til å utforske protein-protein interaksjoner er nøkkelen til å forstå regulatoriske tilkoblinger i cellen. Påvisning av protein-protein interaksjoner i mange tilfeller er imidlertid knyttet til betydelige eksperimentelle utfordringer. Spesielt samhandle sortering reseptorer med frakten protein i lumen membran rom ofte i en vaskemiddel-følsom måte, gjør co-immunoprecipitation av disse proteinene ubrukelig. Binding av sortering reseptoren sortilin til glukose transporter GLUT4 kan tjene som et eksempel på svak luminal vekselsvirkningene mellom membran proteiner. Her beskriver vi en rask, enkel og rimelig analysen for å validere samspillet mellom sortilin og GLUT4. For at har vi utviklet og syntetisk kjemisk myc-merket peptid tilsvarer den potensielle sortilin-binding epitope i den luminal delen av GLUT4. Sortilin merket med seks histidines ble uttrykt i pattedyrceller, og isolert fra cellen lysates bruker kobolt perler. Sortilin immobilisert på perlene ble inkubert med peptid løsning på ulike pH-verdier og eluted materialet ble analysert av vestlige blotting. Denne analysen kan enkelt tilpasses til å studere andre vaskemiddel-sensitive protein-protein interaksjoner.
Introduction
GLUT4 er et glukose transporter protein uttrykt hovedsakelig i fett og skjelettlidelser muskelceller der det formidler effekten av insulin på post prandial blod glukose klaring1. Å være en svært stabil protein, reguleres GLUT4 på et post-translasjonell nivå. I fravær av insulin, GLUT4 er hovedsakelig utelukket fra plasma membranen (derav lav basale permeabilitet for glukose) og er lokalisert hovedsakelig i cellen i små insulin-responsive blemmer (IRVs) og trans-Golgi nettverk (TGN) som sannsynligvis vil representere IRV donor rommet. Ved administrasjon av insulin i IRVs sikring med plasma membranen og levere GLUT4 til området av virksomheten. Dette øker permeabilitet av plasma membranen for glukose, så at glukose opptak fra blod i adipocytter og skjelettlidelser myocytter stiger 10 til 40 ganger. Etter insulin tilbaketrekking, er GLUT4 internalisert i tidlig/sortering endosomes og deretter hentet til TGN hvor IRVs er nytt dannet. Begge sortering skritt i GLUT4 veien, dvs henting fra eksterne tidlig endosomes å perinuclear TGN og dannelsen av IRVs på TGN donor membraner aktiveres som Vps10p familiemedlem, sortilin, som representerer en type jeg transmembrane protein og en sortering reseptor. Ifølge en modell, sortilin fungerer som en transmembrane stillaset protein: det binder GLUT4 i lumen endosomes og TGN, og rekrutterer retromer eller clathrin adaptere til cytoplasmatiske side av den donor membran via sine C-terminus2, 3. Dette forenkler distribusjonen av GLUT4 i vesicula operatører som translocate GLUT4 mellom intracellulær avdelinger.
Samspillet av cytoplasmiske halen av sortilin med retromer og ulike adapter proteiner er godt dokumentert. Binding av sortilin til GLUT4 (og til flere av sine andre protein ligander) har imidlertid vært utfordrende for å bevise. Spesielt har forsøk på å co-immunoprecipitate sortilin og GLUT4 ikke vært vellykket sannsynligvis på grunn av vaskemiddel følsomme natur samspillet mellom disse to proteinene. I tillegg, som en typisk transporter protein, har GLUT4 12 transmembrane domener og 6 luminal looper kombinasjoner som potensielt kan representere en sortilin-binding området. Samtidig, en stor mengde indirekte bevis, som betydelig co lokalisering i cellen cross-linking med membran-permeable DSP og samspillet i gjær to hybridsystem foreslår at sortilin kan binde til GLUT4. Videre har bruker sistnevnte tilnærming i en kombinasjon med alanin skanning mutagenese, vi tidligere fastslått at Vps10p domenet sortilin binder seg primært til første luminal bue av GLUT4. Bevis for slik en samhandling i pattedyrceller har imidlertid vært mangler. Her, vi har isolert hans-merket sortilin fra transfekterte 3T3-L1 celler med kobolt harpiks og viste at det kan kommunisere med kjemisk syntetisert peptid tilsvarer den første luminal løkken av GLUT4 på pH 6 og pH 8 som ligner syreholdig miljø i den endosomal lumen og nøytrale miljø i lumen TGN membraner. Ingen peptid-binding ble oppdaget i kontroll eksperimenter der ekstrakt forberedt fra ikke-transfekterte celler ble lastet på samme perler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin er en evolusjonær bevarte multi ligand protein reseptor som er involvert i både signalnettverk i plasma membranen og intracellulær sortering hendelser6,7. Søk etter den autentiske sortilin ligander (noe som er luminal eller integrert membran proteiner) er imidlertid komplisert som samspillet av sortilin med noen av partnerne bindende synes å være følsomme for vaskemidler. Derfor, en lett og en utbredt tilnærming for å studere protein-protein int…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler DK52057 og DK107498 fra NIH til K.V.K. X.P ble støttet av institusjonelle trening grant 2T32DK007201 fra NIH.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
