Isolasjon protokollen av musen monocytt-avledet dendrittiske celler og deres påfølgende In Vitro aktivisering med Tumor immun komplekser
Summary
Monocytt-avledet DC (MoDC) kan forstand mindre mengder fare-assosiert molekyler og er derfor lett fylt. Vi gir en detaljert protokoll for isolering av MoDC blod svulster og Aktivisering med immun komplekser mens uthevingen nøkkel forholdsregler som bør vurderes for å unngå deres tidlig aktivering.
Abstract
Dendrittiske celler (DC) er heterogene celle populasjoner som avviker i cellemembranen markører, migrasjon og distribusjon, og i deres antigen presentasjon og T celle aktivering kapasiteter. Siden de fleste vaksiner eksperimentelle svulst modeller krever millioner av DC, er de mye isolert fra benmarg eller milten. Men disse DC betydelig forskjellig fra blod og svulst DC i sine Svar å immun komplekser (IC) og formodentlig andre forhold-kombinert Lektiner reseptorer. Viktigst, gitt sensitiviteten av DC til fare-assosiert molekyler, endotoxins eller antistoffer som krysskobling aktivisering reseptorer i en av de isolere kan medføre grunning FM og dermed påvirker parametere, eller minst dosering, må aktivere dem. Derfor beskriver her vi en detaljert protokoll for å isolere MoDC fra blod og svulster og unngå deres tidlig aktivering. I tillegg finnes en protokoll for MoDC aktivering med svulst IC og deres påfølgende analyser.
Introduction
Siden oppdagelsen sin, har dendrittiske celler (DC) vært fokus for omfattende forskning unike evne til å skew T celle differensiering1. De siste tiårene, har et omfattende forskning forsøk søkt å definere ulike DC delsettene og deres funksjon under svulst progresjon og immunitet 2. DCs er sammensatt av ulike celle populasjoner som skiller seg fra hverandre i deres mønstergjenkjenning reseptorer, vev distribusjon, trekkfugler og antigen presentasjon evner3,4,5. Sammenlignet med andre DC undergrupper, monocytt-avledet DC (MoDC) er langt mer rikelig i svulster og lett kan genereres fra sirkulerende eller svulst-infiltrere monocytter6,7. Derfor er mange kliniske forsøk søker å utnytte sin relative utbredelse basert på i vivo og ex vivo manipulering av autologous MoDC for å lokke fram T celle immunitet 8,9.
Tilsvarende DC-baserte vaksinasjon av eksperimentelle svulst modeller krever 2-3 føljetong injeksjoner, 5-7 dagers mellomrom, 1-2 x 106 aktivert DC pulserende med svulst antigener. Derfor, for å oppnå antall DC, de fleste mus studier har primært brukes MoDC kultivert fra benmargen (BM) forløpere i GM-CSF 7-9 dager (IL-4 ikke er nødvendig i innstillingen mus)10,11. Likevel, gitt at GM-CSF knockout mus har samlet normal DC kupé 12,13, og gitt blandet befolkningen fått fra denne kulturen,14 fysiologiske relevansen av disse DC har blitt kalt inn spørsmålet.
Alternativt kan DC være rutinemessig isolert fra milt celler. Imidlertid DC utgjør bare 0,3 0,8% av totale milt celler (resulterer i ca 7 x 105 FM/milt), og av disse cellene, bare CD103+ DC og MoDC kan overføre tilbake til lymfoide organer. Siden MoDCs utgjør ca 10-15% av splenic DC bestander15,16, gir de fleste isolasjon protokoller ca 1 x 105 MoDC per milten. Utvidelse av MoDC kan oppnås ved å injisere transfekterte B16 celler det avsondre GM-CSF, resulterer i en 100-fold økning i splenic MoDC17. Men bruk av MoDC for å utvikle DC vaksiner er begrenset ettersom denne fremgangsmåten ikke kan utføres i mennesker og innhentet MoDC er allerede svært aktivert.
I tillegg til å skaffe tilstrekkelig antall DC, innebærer en utfordring for å utvikle effektive DC vaksiner mot autologous kreftceller mangel på tilstrekkelig fare signaler i innstillingen svulst fullt aktivere DC. Induksjon av co-stimulatory signaler er vanligvis oppnås gjennom aktivering av mønstergjenkjenning reseptorer (PRR), eller c-type Lektiner signalnettverk trasé18,19,20,21. En ytterligere tilnærming for å aktivere DC utnytter deres evne til å ta opp antigener gjennom interaksjoner med overflate Fcγ reseptorer (FcγR). Faktisk en rekke viktige manuskripter har vist at injeksjon av MoDC fra BM forløpere aktivert med svulst-IgG IC kan hindre tumor vekst i forebyggende innstillinger, og kan føre til utrydding av etablerte svulster22,23 .
To nyere verk oppdaget Carmi et al. at i motsetning til BMDC og milt DC, MoDC fra blod og svulster ikke kan svare på IgG KI uten ekstra stimuli. Dette ble funnet for å være av høy intracellulær nivåer av tyrosin phosphatases regulerer FcγR signalering24,25. Ved å definere en kritisk checkpoint i DC, gitt dette arbeidet en viktig innsikt i kravene for vellykket DC-baserte vaksinasjon. Behovet for ytterligere stimuli aktivere FcγR signalering, og antagelig signalene fra andre Lektiner reseptorer bruker en lignende fosforylering cascade, dermed understreker behovet for å unngå grunning FM under deres isolasjon.
Derfor nåværende protokollen beskriver isolering av MoDC fra blod og svulster, som avviker markant BM og milt DC, og fremhever forholdsregler verdt å vurdere under prosessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gitt det store antallet DC kreves for vaccinating mus (ca 2-4 x 106 DC per ett museklikk), de fleste av vaksinasjon strategier i mus er basert på isolering av DC fra BM og milt etterfulgt av ex vivo aktivisering. Imidlertid forsøker å aktivere svulst DC i vivo, bruker de samme betingelsene for å aktivere milten og BM DC, har ofte vært mislykket produsere effektive immunitet. I to påfølgende publikasjoner, Carmi et al. har funnet at blod og tumor MoDC avvike betydelig fra milt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
