Протокол изоляции моноцитарных дендритных клеток мыши и их последующее в Vitro активации с опухоли иммунных комплексов
Summary
Моноцитарных DC (MoDC) может смысле незначительных количествах опасности связанных молекул и поэтому легко загрунтовать. Мы предоставляем подробный протокол для изоляции MoDC от крови и опухоли и их активации с иммунных комплексов, подчеркнув основные меры предосторожности, которые следует рассмотреть, чтобы избежать их преждевременного активации.
Abstract
Дендритные клетки (DC) являются гетерогенной клеточных популяций, которые отличаются в их маркеров клеточной мембраны, модели миграции и распределения и их презентации антигена и возможностей активации Т-клеток. Поскольку большинство прививок экспериментальной опухоли моделей требуют миллионы DC, они широко изолированы от костного мозга и селезенки. Однако эти DC значительно отличаются от крови и опухоли DC в их ответах иммунных комплексов (ИК) и, предположительно, другие Syk сочетании Лектин рецепторов. Важно, учитывая чувствительность DC опасность связанных молекул, присутствие эндотоксинов или антител, которые crosslink активацию рецепторов в одном из изоляции шагов может привести к грунтовки DC и таким образом влияют на параметры, или по крайней мере Дозировка, необходимых для их активации. Таким образом здесь мы опишем подробный протокол для изоляции MoDC из крови и опухоли, избегая их преждевременной активации. Кроме того протокол предусматривает MoDC активации с опухолью IC и их последующего анализа.
Introduction
С момента их открытия дендритные клетки (DC) были в центре внимания обширных исследований из-за их уникальную способность наклонить Т клеточной дифференцировки1. За последние несколько десятилетий обширные исследования стремилась определить различные подмножества DC и их функции в ходе опухолевой прогрессии и иммунитет 2. РСУ состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые отличаются друг от друга в их распознавания рецепторов, распределение ткани, и далеко мигрирующих и антиген презентация возможностей3,4,5. По сравнению с другими DC подмножеств, моноцитарных DC (MoDC) являются гораздо более обильные в опухоли и могут быть легко получены из циркулирующих или опухоль проникновение моноцитов6,7. Таким образом многие клинические испытания, стремящихся воспользоваться их относительную распространенность основаны на in vivo и ex vivo манипуляции аутологичной MoDC для того, чтобы выявить Т-клеток иммунитета 8,9.
Аналогичным образом, DC-основе вакцинации экспериментальной опухоли моделей требует 2-3 последовательных инъекции, 5-7 дней врозь, 1-2 х 106 активированные DC пульсирующий с опухолевых антигенов. Таким образом, для достижения этого большое количество DC, большинство исследований мыши главным образом использовали MoDC культивировали из костного мозга (БМ) прекурсоров в ГМ-КСФ для 7-9 дней (Ил-4 не требуется в параметре мыши)10,11. Тем не менее учитывая что нокаут ГМ-КСФ у мышей в целом нормальное DC отсек 12,13и смешанным населением, полученные от этой культуры,14 физиологической значимости этих DC была поставлена под вопрос.
Кроме того DC может быть регулярно изолированы от клеток селезенки. Однако, DC составляют лишь около 0,3-0,8% всего селезенка клеток (в результате приблизительно 7 x 105 DC/селезенки) и эти клетки, только CD103+ DC и MoDC можно перенести обратно в лимфоидных органов. Поскольку MoDCs составляют примерно 10-15% населения15,селезеночной DC16, большинство протоколы изоляции дают примерно 1 х 105 MoDC в селезенке. Расширение MoDC может достигаться путем инъекций transfected клеток В16, которые выделяют ГМ-КСФ, что приводит к 100-кратного увеличения селезенки MoDC17. Однако, использование MoDC для разработки вакцин DC ограничен, поскольку эта процедура не может быть сделано в организме человека и полученные MoDC уже высоко активируются.
Помимо получения достаточного количества DC, еще один вызов для разработки эффективных DC вакцин против аутологичной раковых клеток предполагает отсутствие достаточных сигналы опасности в параметре опухоль полностью активировать DC. Индукции co-stimulatory сигналов обычно достигается путем активации распознавания рецепторов (ПРР), или тип c Лектин сигнальных путей18,19,20,21. Еще один подход для активации DC эксплуатирует их способности принимать антигены путем взаимодействия с поверхности Fcγ рецепторы (FcγR). Действительно, ряд важных рукописей показали, что инъекции MoDC от БМ прекурсоров, активированный с опухоль IgG IC может предотвратить рост опухоли в профилактической настройки и может привести к ликвидации установленных опухоли22,23 .
В двух последних документах Карми et al. обнаружил, что в отличие от BMDC и селезенке DC, MoDC из крови и опухоли не может реагировать IgG IC без дополнительных стимулов. Это было признано благодаря наличию внутриклеточного уровня тирозин фосфатаз, регулирующие FcγR сигнализации24,25. Определение критических контрольных точек в DC, эта работа представил важное понимание требований для успешной вакцинации на базе DC. Потребность в дополнительных стимулов для включения FcγR сигнализацию и предположительно сигнализации от других рецепторов Лектин, используя аналогичные фосфорилирование Каскад, таким образом подчеркивает необходимость избегать грунтование DC во время их изоляции.
Таким образом настоящий Протокол описывает изоляции MoDC от крови и опухоли, которые заметно отличаются от БМ и селезенке DC, и освещаются меры предосторожности стоит рассмотреть во время процесса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Учитывая большое количество DC, необходимых для вакцинации мышей (около 2-4 x 106 DC за одну мышь), большая часть стратегии в мышах основаны на изоляции DC от БМ и селезенки, следуют их активации ex vivo вакцинации. Однако попытки активировать опухоли DC в естественных условиях, испо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нет
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
