Isolering protokoll mus monocyt-derived dendritiska celler och deras efterföljande In Vitro -aktivering med tumör immunkomplex
Summary
Monocyt-derived DC (MoDC) kan känna mindre mängder fara-associerade molekyler och är därför enkelt primas. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för isolering av MoDC från blod och tumörer och deras aktivering med immunkomplex samtidigt belysa viktiga försiktighetsåtgärder som bör övervägas för att undvika deras tidig aktivering.
Abstract
Dendritiska celler (DC) är heterogena cellpopulationer som skiljer sig i deras cellmembranet markörer, migrationsmönster och distribution, och i sin antigen-presentation och T-cells aktivering kapacitet. Eftersom de flesta vaccinationer av experimentella tumör modeller kräver miljontals DC, är de ofta isolerade från benmärgen eller mjälte. Dock dessa DC avsevärt skiljer sig från blod och tumör DC i sina svar att immunkomplex (IC) och förmodligen andra Syk-kopplade lektin-receptorer. Ännu viktigare, med tanke på känsligheten hos DC fara-associerade molekyler, närvaro av endotoxiner eller antikroppar som crosslink aktiveringen receptorer i en av de isolera kliver kunde resultera i grundningen av DC och därmed påverka parametrarna, eller åtminstone de dosering, krävs för att aktivera dem. Därför, här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera MoDC från blod och tumörer samtidigt undvika deras tidig aktivering. Dessutom finns ett protokoll för MoDC aktiveringen med tumör IC och deras efterföljande analyser.
Introduction
Dendritiska celler (DC) har sedan upptäckten, fokus omfattande forskning på grund av sin unika förmåga att förvränga T cell differentiering1. Under de senaste decennierna, har en omfattande forskningsinsats försökt att definiera de olika DC-underdelar och deras funktion under tumör progression och immunitet 2. DCs består av heterogena cellpopulationer som skiljer sig från varandra i deras mönsterigenkänning receptorer, vävnadsdistribution, och flyttande och antigen-presentation kapacitet3,4,5. Jämfört med andra DC delmängder, monocyt-derived DC (MoDC) är långt mer rikligt i tumörer och enkelt kan genereras från cirkulerande eller tumör-infiltrera monocyter6,7. Därför baseras många kliniska prövningar som försöker dra nytta av deras relativa förekomst på in-vivo och ex vivo manipulation av autologa MoDC för att framkalla T cell immunitet 8,9.
Likaså, DC-baserade vaccination av experimentella tumör modeller kräver 2-3 seriella injektioner, 5-7 dagars mellanrum, 1-2 x 106 aktiverade DC pulsade med tumör antigener. Därför, för att uppnå detta stora antal DC, de flesta mus-studier har främst använt MoDC odlade från benmärgen (BM) prekursorer i GM-CSF för 7-9 dagar (IL-4 behövs ej i inställningen för mus)10,11. Dock har hänsyn till att GM-CSF knockout möss har övergripande normala DC fack 12,13, och de blandade populationer som erhållits från det kulturen,14 fysiologiska relevansen av dessa DC ifrågasatts.
Alternativt, DC kan isoleras rutinmässigt från mjältceller. Men DC bestå endast ca 0,3-0,8% av totala mjältceller (resulterar i cirka 7 x 105 DC/mjälte), och av dessa celler, endast CD103+ DC och MoDC kan migrera tillbaka till lymfoida organ. Eftersom MoDCs består av ca 10-15% av mjälten DC populationer15,16, ge de flesta isolering protokoll ca 1 x 105 MoDC per mjälte. Expansion av MoDC kan uppnås genom att injicera transfekterade B16-celler som utsöndrar GM-CSF, vilket resulterar i en 100-faldig ökning av mjälten MoDC17. Användning av MoDC för att utveckla DC vacciner är dock begränsad, eftersom detta förfarande inte kan göras hos människor och det erhållna MoDC aktiveras redan mycket.
Utöver att få ett tillräckligt antal DC, innebär en annan utmaning för att utveckla effektiva DC vacciner mot autolog cancerceller bristen på tillräcklig varningssignaler i inställningen tumör fullt Aktivera DC. Induktion av co-stimulatory signaler uppnås vanligen genom aktivering av mönsterigenkänning receptorer (PRR), eller c-typen lektin signalering vägar18,19,20,21. En ytterligare metod för att aktivera DC utnyttjar sin förmåga att ta upp antigener genom interaktioner med surface Fcγ-receptorer (FcγR). Faktiskt, ett antal viktiga manuskript har visat att injektion av MoDC från BM prekursorer aktiveras med tumör-IgG IC kan förhindra tumörtillväxt i profylaktisk inställningar, och kan leda till utrotning av etablerade tumörer22,23 .
I två nyligen papper upptäckte Carmi et al. att MoDC från blod och tumörer i motsats till BMDC och mjälte DC, inte kan svara på IgG IC utan ytterligare stimuli. Detta befanns vara på grund av höga intracellulära nivåer av tyrosinfosfataser som reglerar FcγR signalering24,25. Genom att definiera en kritisk kontrollpunkt i DC, som detta arbete en viktig inblick i kraven för framgångsrik DC-baserade vaccination. Kravet för ytterligare stimuli för att aktivera FcγR signalering, och förmodligen signalering från andra lektin receptorer utnyttja en liknande fosforylering cascade, understryker därför behovet av att undvika grundningen av DC under deras isolering.
Därför protokolls beskriver isolering av MoDC från blod och tumörer, som skiljer sig markant från BM och mjälte DC, och handlar om förebyggande säkerhetsföreskrifter värt att överväga under processen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med tanke på det stora antalet DC krävs för vaccinering möss (cirka 2-4 x 106 DC per en mus), de flesta av vaccinationen strategier hos möss är baserade på isolering av DC från BM och mjälte följt av deras ex vivo -aktivering. Dock försöker aktivera tumör DC in-vivo, med samma villkor för att aktivera mjälte och BM DC, har ofta misslyckats i att producera effektiva immunitet. I två publikationer, Carmi et al. har hittat att blod och tumör MoDC skiljer sig markant fr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
