À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

Résumé

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

Résumé

La capacité de différencier les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) en cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) offre de nouvelles possibilités pour l’étude des erreurs innées du métabolisme hépatique. Toutefois, afin de fournir une plate-forme qui prend en charge l’identification de petites molécules qui peut potentiellement être utilisé pour traiter les maladies du foie, cette procédure nécessite un format de culture qui est compatible avec des milliers de composés de dépistage. Nous décrivons ici un protocole utilisant des conditions de culture entièrement définie, qui permettent la différenciation reproductible de CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes en plaques 96 puits vitroplants. Nous fournissons également un exemple d’utilisation de la plateforme aux composés d’écran pour leur capacité d’abaisser l’apolipoprotéine B (APOB) produite à partir des hépatocytes iPSC dérivés produits d’un patient de l’hypercholestérolémie. La disponibilité d’une plate-forme qui est compatible avec la découverte de médicaments devrait permettre aux chercheurs d’identifier de nouveaux traitements pour les maladies qui affectent le foie.

Introduction

Succès dans l’identification des médicaments qui peuvent servir à cibler une maladie rare se fonde sur le développement de tests qui peut être utilisé pour le dépistage. Hypothèse ou écrans axée sur la cible (pharmacologie inverse) sont utiles, mais nécessitent une compréhension détaillée de la base moléculaire de la maladie. Les écrans phénotypiques (pharmacologie classique) éviter la nécessité d’une compréhension détaillée des voies biochimiques, mais reposent plutôt sur l’élaboration de modèles qui reflètent avec précision la physiopathologie de la maladie. Malgré l’enthousiasme pour les approches axées sur la cible, des médicaments de première catégorie approuvés ....

Protocole

1. culture de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

1. Revêtement recombinant humain protéine de Fusion Fc E-cadhérine (E-cad-Fc) ou autres matrices appropriés pour la culture de hPSC ⁶
   1. Diluer le E-cad-Fc à 15 μg/mL avec Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco contenant du calcium et du magnésium (SPD (+)).
   2. Manteau plats de vitroplants de suspension 100 mm avec 5 mL de E-cad-Fc dilué et incuber à 37 ° c pendant au moins 1 h substrat supprimer et remplacer par 5 mL de milieu (par exemple, mTeSR1 appelé M-moyen désormais)⁷.
      Remarque : ....

Résultats

Génération des hépatocytes - aime les cellules : La figure 1 représente le calendrier des changements qui se produisent au cours de la différenciation du CISP humain à cellules semblables à des hépatocytes. La culture de la CISP sur E-Cad-Fc fournit environ 2 mm des colonies de diamètre qui expriment le marqueur pluripotentes OCT4 (Figure 1 a-B). La morphologie d.......

Discussion

Découverte de médicaments cible basé, où les petites molécules sont identifiées qui influent sur l’activité d’une protéine spécifique, a fait l’objet de nombreux efforts de dépistage existants. Bien que cette approche a fourni de nombreux produits pharmaceutiques, écrans, basés sur l’inversion d’un phénotype, la pharmacologie classique, ont eu plus de succès dans l’identification des composés de première catégorie qui ont été cliniquement efficace¹. Un inconvénient à la découverte de médicaments p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes stériles de culture tissulaire de 100 mm x 20 mm  ;	Boîtes	Corning 430167
100 mm x 20 mm	430591
Plaque de culture tissulaire Corning à 96 puits	Corning	3595
Anti-humane Albumine	Dako	A 0001
Anti-humain FOXA2(6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
Anti-humain HNF4 alpha	Santa Cruz	SC-6556
Anti-humain Oct-3/4 Anticorps	Santa Cruz	SC-9081
Anti-humain SOX17	R& D	AF1924
Protéine humaine conjuguée TRA-1-60 FITC FCMAB115F
Activine A Protéine humaine recombinante  ;	Supplément d’Invitrogen	PHC9563
B-27, moins l’insuline.	Invitrogen	0050129SA
B-27 Supplément, sans sérum	Invitrogen	17504044
protéine humaine recombinante BMP4	Invitrogen	PHC9533
réactif de dissociation cellulaire StemPro  ; Accutase  ;	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente  ;	Promega	7572
DPBS+(calcium, magnésium)	Invitrogen	14040-133
DPBS-(sans calcium, sans magnésium)	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12, HEPES  ;	Invitrogen	11330057
ELISA humain APOB Kit de développement ELISA	Mabtech	3715-1H-20
Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2)Milieu	Invitrogen	PHG0023
(HCM Bullet Kit)  ;	Lonza	CC-3198
Facteur de croissance des hépatocytes  ; (HGF)	Invitrogen	PHC0321
L-Glutamine  ;	Invitrogen	25030081
MEM Solution d’acides aminés non essentiels	Invitrogen	11140076
Oncostatin M (OSM) Protéine humaine recombinante  ;	Invitrogen	PHC5015
Pénicilline-Streptomycine  ;
: mTesR1  ;	STEMCELL technologies	5850
Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit  ;	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  ;	Invitrogen	22400105
StemAdhere Defined Matrix pour hPSC (E-CAD-FC)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA Substrate Solution	Thermo Scientific  ;	34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugué	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0,02 %  ;	Lonza	17-711E
Y-27632 Inhibiteur	ROCK STEMCELL Technologies	72302

de culture en suspension stériles de culture d’hépatocytes Milieu de cellules souches pluripotentes sans distributeur d’Invitrogen 15140163 de