في الجسم الحي الفحص المجهري بالليزر قبل السريري المقترن بالألياف (pCLE) للشعيرات الدموية الحصين في الفئران المستيقظة
Summary
في حين أن التصوير متعدد الفوتونات فعال فقط على أعماق محدودة من سطح الأنسجة ، فمن الممكن تحقيق تصوير بدقة 3 ميكرومتر في أي عمق عبر pCLE. هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء تصوير pCLE لقياس ديناميكيات الأوعية الدموية الدقيقة في الحصين للفئران من النوع البري.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو وصف الفحص المجهري بالليزر قبل السريري البؤري المقترن بحزمة الألياف الضوئية (pCLE) في تطبيقه المحدد لتوضيح تأثيرات تدفق الدم الشعري أثناء النوبات ، مدفوعة بالخلايا الجدارية. أظهر التصوير القشري في المختبر وفي الجسم الحي أن انقباضات الشعيرات الدموية التي تقودها الخلايا المحيطة يمكن أن تنتج عن النشاط العصبي المحلي الوظيفي ، وكذلك من تطبيق الدواء ، في السليمة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول حول كيفية استخدام pCLE لتحديد دور ديناميات الأوعية الدموية الدقيقة في التنكس العصبي في الصرع ، في أي عمق الأنسجة (على وجه التحديد في الحصين). وصفنا تقنية تقييد الرأس التي تم تكييفها لتسجيل pCLE في المستيقظة ، لمعالجة الآثار الجانبية المحتملة للتخدير على النشاط العصبي. باستخدام هذه الطرق ، يمكن إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتصويرية على مدار عدة ساعات في الهياكل العصبية العميقة للدماغ.
Introduction
على النقيض من طرق التصوير المجهري الأخرى1،2،3،4،5،6،7،8 ، يسمح الفحص المجهري متحد البؤر القائم على الألياف البصرية في الجسم الحي بقياس ديناميكيات تدفق الدم في أي منطقة دماغية ، في أي عمق ، بسرعة عالية (تصل إلى 240 هرتز حسب حجم مجال الرؤية9). يتيح مسبار الألياف الضوئية التصوير بالليزر متحد البؤر في الجسم الحي بدقة 3 ميكرومتر لأن طرف المسبار (هدف بدون عدسة يتكون من حزمة من الألياف الفردية بقطر 5000-6000 3 ميكرومتر) يمكن وضعه بدقة قطب كهربائي دقيق ، في حدود 15 ميكرومتر من هدف الفلورسنت محل الاهتمام. كما هو الحال مع التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي ، يجب إدخال الفلوروفورات مسبقا في هدف التصوير. على سبيل المثال ، يمكن حقن فلوريسئين ديكستران (أو النقاط الكمومية) في الأوعية الدموية ، أو يمكن نقل البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا إلى الخلايا ، أو يمكن تحميل الأصباغ الفلورية مثل Oregon Green BAPTA-1 بكميات كبيرة في الخلايا ، قبل التصوير.
وجدت الأبحاث الحديثة التي تستخدم هذه التقنيات أن النشاط الحركي للخلايا الجدارية الذي يؤدي إلى التشنجات الوعائية الشعرية – الانقباضات المفاجئة التي تحدث في موضع الخلايا الجدارية أثناء النوبات 9 – يمكن أن يساهم في التنكس العصبي في الحصين9. في حين أظهرت دراسات التصوير السابقة في المختبر وفي الجسم الحي انقباضات pericyte مرتبطة بتطبيقات الأدوية6،7،10،11،12 ، وجد Leal-Campanario et al. أول دليل على انقباضات شعرية عفوية في الجسم الحي في دماغ الفئران. لإثبات الصلة بصرع الفص الصدغي البشري ، درسوا ذكور (P30-40 القديمة) بالضربة القاضية (KO) Kv1.1 (kcna1-null) الفئران 14,15 (مخزون JAX # 003532) ، وهو نموذج وراثي للرنح العرضي البشري من النوع 115. قادت Pericytes كلا من تضيقات الأوعية الجدارية الحصين المرضيةوالفسيولوجية 9 في المصابة بالصرع تلقائيا وزملائها من النوع البري (WT). تم تكرار هذه الملاحظات في WT التي أصيبت بالصرع بحمض الكينيك ، مما يشير إلى تعميمها على أشكال أخرى من الصرع. علاوة على ذلك ، قرر Leal-Campanario وآخرون ، باستخدام مناهج مجهرية مجهرية مجسمة جديدة ، أن الخلايا العصبية غير الصالحة – ولكن ليست صحية – في المصابة بالصرع كانت مقترنة مكانيا بالأوعية الدموية الدقيقة في الحصين. نظرا لأن السمية الاستثارية ليس لها ارتباط مكاني معروف بالأوعية الدموية ، فقد أشارت هذه النتيجة إلى أن نقص الأكسجة الناجم عن نقص الأكسجة الناجم عن نقص التروية الشعرية الشعرية غير الطبيعي يساهم في التنكس العصبي في الصرع. يوضح الشكل 1 مخططا للإعداد العام.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير نظام تقييد غطاء الرأس لتجارب pCLE الكهربية والألياف البصرية المتزامنة في الفئران المستيقظة ، مما يقلل من تلوث الاستجابة المحتملة بسبب الأدوية المخدرة. غطاء الرأس وجهاز التركيب سهل البناء ويمكن إعادة استخدامه لتجارب التصوير المزمنة التي تتصرف مستيقظا. تحققنا من جودة التسجيلات …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل المشروع من خلال جائزة مبادرة بحثية من جمعية الصرع الأمريكية ، وجائزة من لجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية إلى SLM ، بالإضافة إلى منحة تحدي من Research to Prevention Blindness Inc. إلى قسم طب العيون في جامعة ولاية نيويورك داونستيت للعلوم الصحية ، برنامج إمباير إمباير للابتكار في ولاية نيويورك ، ومنح أخرى من المؤسسة الوطنية للعلوم (0726113 و 0852636 و 1523614) ، ومؤسسة بارو العصبية ، والسيدة ماريان روشيل ، والسيدة جريس ويلتون ، وجوائز Dignity Health SEED ، والمنح الفيدرالية من المؤسسة الوطنية للعلوم (0726113 و 0852636 و 1523614) والمعهد الوطني للصحة (جوائز R01EY031971 و R01CA258021) ، إلى SLM و SMC تم دعم هذا العمل أيضا من قبل مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية بموجب الجائزة رقم. W81XWH-15-1-0138 ، إلى SLM. تم دعم L.-C. من خلال زمالة José Castillejo من وزارة التعليم الإسبانية. كاباليرو والسيد ليدو على مشورتهما ومساعدتهما التقنية.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neurosciences. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
