Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione
Summary
Combinazioni di farmaci sinergici sono difficile e richiede molto tempo per identificare empiricamente. Qui, descriviamo un metodo per identificare e convalidare sinergiche piccole molecole.
Abstract
Anche se farmaci antimicrobici hanno aumentato drammaticamente la durata e la qualità della vita nel 20° secolo, la resistenza antimicrobica minaccia la capacità di tutta la nostra società di trattare infezioni sistemiche. Negli Stati Uniti da solo, infezioni resistenti agli antibiotici uccidono circa 23.000 persone un anno e il costo circa 20 miliardi USD nel settore sanitario aggiuntiva. Un approccio per combattere la resistenza antimicrobica è terapia di combinazione, che è particolarmente utile nella critica fase iniziale dell’infezione, prima che l’organismo d’infezione e del relativo profilo di resistenza di droga sono stati identificati. Molti trattamenti antimicrobici utilizzano terapie di combinazione. Tuttavia, la maggior parte di queste combinazioni sono additivo, che significa che l’efficacia combinata è lo stesso come la somma dell’efficacia antibiotica individuo. Alcune terapie di combinazione sono sinergiche: l’efficacia combinata è molto maggiore di additivo. Combinazioni sinergiche sono particolarmente utili perché possono inibire la crescita di ceppi resistenti ai farmaci antimicrobici. Tuttavia, queste combinazioni sono rari e difficili da identificare. Ciò è dovuto il numero di molecole necessarie per essere testato in modo pairwise: una libreria di 1.000 molecole ha 1 milione di combinazioni possibili. Così, sono compiuti sforzi per predire le molecole per sinergia. Questo articolo viene descritto il nostro metodo di alto-rendimento per pronosticare coppie sinergica piccola molecola conosciute come la sovrapposizione2 metodo (O2M). O2M utilizza modelli di set di dati chimico-genetica per identificare i mutanti che sono ipersensibili ad ogni molecola in una coppia sinergica ma non ad altre molecole. Il laboratorio marrone sfrutta questa differenza di crescita eseguendo uno schermo ad alta produttività per molecole che inibiscono la crescita di mutante ma non selvaggio-tipo celle. Lavoro del laboratorio precedentemente identificate molecole che agendo in sinergia con l’antibiotico trimetoprim e il fluconazolo antimicotico usando questa strategia. Qui, gli autori presentano un metodo per schermo per nuove combinazioni sinergiche, che può essere modificato per molteplici microrganismi.
Introduction
Batteri resistenti agli antibiotici causano infezioni più di 2 milioni e 23.000 morti ogni anno negli Stati Uniti secondo il CDC1. Nuovi trattamenti sono necessari per superare queste infezioni. Le strategie per identificare questi nuovi trattamenti includono lo sviluppo di nuovi farmaci antimicrobici o il riuso di piccole molecole approvate per le altre condizioni per il trattamento di infezioni microbiche2,3,4. Tuttavia, la nuova scoperta della droga è molto costoso e richiede tempo. Repurposing farmaci potrebbe non identificare nuovi farmaci o obiettivi della droga di5,6. Il nostro laboratorio si concentra su una terza strategia conosciuta come terapie di combinazione sinergica. Combinazioni sinergiche si verificano quando due piccole molecole insieme hanno un’efficacia maggiore l’effetto additivo di loro efficacies individuale7. Inoltre, combinazioni sinergiche possono essere efficace contro un agente patogeno resistente a una delle piccole molecole nella coppia oltre ad avere meno effetti indesiderati fuori bersaglio, rendendoli grande potenziale8,9, 10.
Coppie sinergiche sono rare, che si verificano in circa 4-10% di droga combinazioni11,12,13. Così, tecniche tradizionali come schermi pairwise sono difficile e faticosa, con migliaia di combinazioni possibili da una piccola biblioteca di un centinaio di molecole. Inoltre, interazioni sinergiche solitamente non possono essere previsto dall’attività dei composti14. Tuttavia, gli autori hanno sviluppato un approccio di alto-rendimento alla schermata per coppie sinergiche, chiamato sovrapposizione2 Method (O2M)12. Questo metodo, descritto qui, consente per l’identificazione più veloce, più efficiente di questi accoppiamenti sinergici. O2M richiede l’utilizzo di una coppia di sinergica nota e un set di dati di chimica-genetica. Chimica-genetica DataSet vengono generati quando una libreria di mutanti knockout è coltivata in presenza di molte piccole molecole diverse. Se una molecola in una coppia di sinergica nota induce lo stesso fenotipo da un mutante di knockout particolare come la seconda molecola sinergica, qualsiasi altra piccola molecola che suscita il fenotipo da quello stesso mutante dovrebbe anche potenziare con ogni membro del conosciuto coppia sinergica. Questa logica è stata utilizzata nel laboratorio di marrone per identificare sinergiche coppie antibiotiche attive contro Escherichia coli (Escherichia coli) e sinergica farmaco antifungino attivo contro il fungo patogeno Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M non solo è adattabile per vari agenti patogeni, ma per lo screening di grandi librerie di molecole permette di identificare le coppie di sinergiche facilmente e rapidamente. Lo screening con il mutante genetico identificato da O2M permette di convalidare solo quelle piccole molecole preveduti per sinergia. Così, una libreria di 2.000-molecola per i test pairwise Occorrerebbero mesi, considerando che se c’erano solo 20 molecole in quanto Biblioteca preveduta a sinergizzare, test per sinergia ora prende una questione di giorni. O2M non richiede competenze di programmazione, e l’attrezzatura necessaria è disponibile nella maggior parte dei laboratori o strutture di nucleo. Oltre ai ricercatori interessati a combinazioni di farmaci, analisi O2M sono di interesse a chiunque che ha completato un test antidroga e vuole espandere i loro successi identificando le interazioni farmaco-farmaco importante. Di seguito è riportato il protocollo per l’identificazione di molecole piccole sinergiche nei batteri, nonché di convalidare il predetto interazioni sinergiche in dosaggi ben noto15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coppie di sinergica piccola molecola possono essere un potente strumento nel trattamento di infezioni microbiche, ancora non hanno raggiunto il loro potenziale clinico completo perché sinergiche coppie sono difficili da identificare. Questo articolo descrive un metodo per identificare sinergiche coppie molto più veloce di semplici combinazioni di coppie. Utilizzando i set di dati di chimica-genetica, O2M identifica mutanti con KO di gene che quindi può essere utilizzato come una lettura di librerie di grandi dimension…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di avvio dal dipartimento di patologia, Università dello Utah per J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
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