Perfusable vaskulære netværk med en væv Model i en mikrofluid enhed
Summary
Protokollen beskriver, hvordan du ingeniør en perfusable vaskulære netværk i en klumpformet. Den sfæroide omkringliggende mikromiljø er udtænkt for at fremkalde angiogenese og forbinde sfæroide til microchannels i en mikrofluid enhed. Metoden tillader perfusion af den sfæroide, der er en længe ventet teknik i tre-dimensionelle kulturer.
Abstract
En klumpformet (en flercellet samlet) betragtes som en god model for levende væv i den menneskelige krop. Trods betydelige avancement i klumpformet kulturer forbliver en perfusable vaskulære netværk i spheroids en kritisk udfordring til langtidskulturer forpligtet til at opretholde og udvikle deres funktioner, såsom protein udtryk og morfogenese. Protokollen præsenterer en ny metode for at integrere en perfusable vaskulære netværk inden for klumpformet i en mikrofluid enhed. For at fremkalde en perfusable vaskulære netværk i sfæroide, blev angiogene spirer tilsluttet microchannels guidet til sfæroide ved at udnytte angiogene faktorer fra menneskelige lunge fibroblaster kulturperler i sfæroide. Angiogene spirer nåede sfæroide, fusioneret med i endothelial celler Co kulturperler i sfæroide, og dannede en kontinuerlig vaskulære netværk. Den vaskulære netværk kunne perfuse indre af sfæroide uden enhver lækage. Den beregnede vaskulære netværk kan anvendes yderligere som en rute til levering af næringsstoffer og fjernelse af affaldsprodukter, efterligne blod omløb in vivo. Metoden giver en ny platform i klumpformet kultur mod bedre sammenfatning af levende væv.
Introduction
Flytte fra en éncellelag (todimensional) kultur til en tre-dimensionel kultur er motiveret af behovet for at arbejde med kultur-modeller, der efterligner de cellulære funktioner af levende væv1,2,3. Fladt og hårdt plast substrater almindeligt anvendt i cellekultur ligner ikke de fleste af de ekstracellulære miljøer i den menneskelige krop. I virkeligheden, viser mange undersøgelser, at tre-dimensionelle kultur genskabe væv-specifikke arkitektur, mekaniske og biokemiske stikord og cell-celle kommunikation, som ikke er blevet observeret i konventionelle to-dimensionelle kultur4, 5,6,7,8.
En flercellet aggregat eller sfæroide, er en af de mest lovende teknikker til at realisere denne tre-dimensionelle kultur9,10. Celler udskiller den ekstracellulære matrix (ECM) og kan kommunikere med andre i sfæroide. Selv om nogle andre bioteknologi tilgange11,12,13,14, såsom celle stabling, med held kopiere rumlige kompleksiteten af det menneskelige legeme, disse tilgange har kun to eller tre former for celler for lethed af analyse og fokuseret på kun én funktion af målorganer. Derimod udsættes celler i spheroids for forskellige kultur miljøer afhængig af deres positioner i klumpformet på grund af de heterogene levering af næringsstoffer, ilt, og paracrine og autocrine signalering molekyler i sfæroide. Denne funktion af spheroids efterligner delvist i vivo kultur tilstand og aktivere celler i spheroids at skabe langt mere komplekse, organiseret væv struktur i vitro end kulturperler i stabling væv9, 15 , 16. Bemærk, at hvis en klumpformet består af en enkelt slags celler, funktionen af cellerne i sfæroide ikke er ensartet på grund af de heterogene miljø i sfæroide. I de sidste par år, klumpformet kulturer tilladt embryonale stamceller (økonomiske), induceret pluripotente stamceller (iPSCs) eller væv-resident stamceller til at efterligne i vivo udviklingsmæssige sekvenser og genskabe mini-organer som hjerne17, leveren18og nyrerne19,20.
Trods betydelige fremskridt i klumpformet kultur teknikker er dyrkning store spheroids i lang tid stadig problematisk. I en tre-dimensionel væv skal celler være placeret inden for 150-200 µm i en blodåre på grund af det begrænsede udbud af ilt og næringsstoffer21. Vaskulære netværk inden for sfæroide er nødvendige for at sammenfatte udveksle stoffer mellem blod og væv in vivo. For at opnå dette, har andre grupper Co kulturperler endotelceller med target celler22,23,24 eller induceret pluripotente celler differentiering i CD31-positive celler20. De rapporterede fartøj-lignende strukturer har dog ikke de åbne ender af lumina at levere ilt og næringsstoffer til midten af sfæroide. For at efterligne den vaskulære rolle for at nære cellerne i de tre-dimensionelle kultur, skal åben og perfusable vaskulære netværk udvikles i sfæroide.
I løbet af de sidste par år, nogle forskningsgrupper i feltet microengineering rapporteret metoder til at konstruere en perfusable vaskulære netværk, spontant dannet i en mikrofluid enhed ved at udnytte angiogene faktorer fra cocultured fibroblastceller25 ,26. Disse vaskulære netværk har en lignende morfologi til deres i vivo modparter og kan være ombygget af miljømæssige faktorer, hvilket gør dem egnede til efterligne vaskulære funktioner i en klumpformet kultur. Formålet med denne protokol er at konstruere en perfusable vaskulære netværk i en sfæroide, ved hjælp af en mikrofluid platform27. Enhedens mikrofluid er ændret fra de tidligere rapporterede enhed25 , så en klumpformet kan indarbejdes. Ved at lede angiogene sekretion fra fibroblastceller i en klumpformet i endothelial celler i microchannels, angiogene spirer fra microchannels anastomosed med sfæroide og dannet en perfusable vaskulære netværk. Denne metode giver mulighed for en direkte levering af en lang række stoffer, som fluorescerende molekyler og mikrometer skala perler ind i indre af en sfæroide, som danner rammen for en langsigtet vævskultur med vaskulære netværk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere rapporter viser, at hLFs udskiller en cocktail af flere angiogene faktorer, såsom angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyt vækstfaktor, omdanne vækst faktor-α, tumor nekrose faktor og nogle ekstracellulære matrix proteiner29, 30. Denne analyse er afhængig af angiogene sekretion fra hLFs i en coculture sfæroide, der er begrænsningen i teknikken. Derfor er det afgørende for en stabil vaskulære formation til at fastsætte en coculture klumpformet i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af CREST JST (grant nummer JPMJCR14W4), samfund for at fremme af videnskab (JSP’ER) KAKENHI (grant nummer 25600060, 16K 16386), The Center for Innovation Program fra MEXT og JST, projekt fokuseret på at udvikle nøglen evaluering teknologi fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED, Mizuho fundament til fremme af videnskab. Microfabrication blev støttet af Kyoto University Nano teknologi Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
