Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat
Summary
Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.
Abstract
Een sferoïde (een meercellig aggregaat) wordt beschouwd als een goed model voor levende weefsels in het menselijk lichaam. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de sferoïde culturen blijft een perfusable vasculaire netwerk in de spheroïden een essentiële uitdaging voor langetermijnkweek moeten handhaven en ontwikkelen van hun functies, zoals eiwit expressies en voedselproductie. Het protocol presenteert een nieuwe methode om het integreren van een perfusable vasculaire netwerk binnen de sferoïde in een microfluidic apparaat. Om een perfusable vasculaire netwerk in de sferoïde, werden naar de sferoïde angiogenic spruiten verbonden met microchannels geleid door gebruik te maken van angiogenic factoren van menselijke longen fibroblasten gekweekt in de sferoïde. De angiogenic spruiten bereikt de sferoïde, samengevoegd met de endotheliale cellen samen gekweekt in de sferoïde, en vormden een continue vasculaire netwerk. De vasculaire netwerk kan perfuse het interieur van de sferoïde zonder lekkages. Het geconstrueerde vasculaire netwerk kan verder worden gebruikt als een route voor de toevoer van voedingsstoffen en verwijdering van afvalstoffen, het nabootsen van bloed omloop in vivo. De methode biedt een nieuw platform in sferoïde cultuur naar betere recapitulatie van levende weefsels.
Introduction
Verschuiven van een enkelgelaagde (tweedimensionaal) cultuur naar een driedimensionale cultuur is ingegeven door de noodzaak om te werken met cultuur-modellen die na te de cellulaire functies van levende bootsen weefsels1,2,3. Vlakke en harde kunststof ondergronden gebruikte in celkweek lijken niet allermeest naar de extracellulaire omgeving in het menselijk lichaam. In feite, veel studies tonen aan dat driedimensionale cultuur opnieuw weefsel-specifieke architectuur, mechanische en biochemische signalen en cel-cel communicatie, die niet in conventionele tweedimensionale cultuur4waargenomen zijn, 5,6,7,8.
Een meercellig aggregaat of sferoïde, is een van de meest veelbelovende technieken om te beseffen dit driedimensionale cultuur9,10. Cellen afscheiden van de extracellulaire matrix (ECM) en in de sferoïde met anderen kunnen communiceren. Hoewel sommige andere bioengineering benaderingen11,12,13,14, zoals cel stapelen, met succes het repliceren van ruimtelijke complexiteit van het menselijk lichaam, deze benaderingen hebben slechts twee of drie soorten cellen voor het gemak van de analyse en gericht op slechts één functie van de doelorganen. In tegenstelling, worden cellen in de spheroïden blootgesteld aan verschillende cultuur omgevingen afhankelijk van hun posities in de sferoïde vanwege de heterogene levering van voedingsstoffen, zuurstof, en paracrine en autocrine moleculen in de sferoïde signalering. Deze functie van spheroïden bootst gedeeltelijk in vivo cultuur voorwaarde, zodat de structuur van de cellen in de spheroïden maken veel complexer, georganiseerde weefsel in vitro dan die gekweekt in de stapelvolgorde weefsel9, 15 , 16. als een sferoïde uit een enkele soort cellen bestaat, de functie van de cellen in de sferoïde is niet uniform vanwege de heterogene omgeving in de sferoïde. In de afgelopen jaren, sferoïde culturen toegestaan embryonale stamcellen (SER’s), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) of weefsel-ingezeten stamcellen te bootsen in vivo developmental sequenties en opnieuw mini-organen zoals de hersenen17, lever18en nier19,20.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in sferoïde cultuur technieken, het kweken van grote spheroïden voor een lange tijd is nog steeds problematisch. In een drie-dimensionale weefsel moeten cellen bevinden binnen 150-200 µm van een bloedvat vanwege het beperkte aanbod van zuurstof en voedingsstoffen21. Vasculaire netwerken binnen de sferoïde zijn nodig om de uitwisseling van stoffen tussen het bloed en de weefsels in vivorecapituleren. Om dit te bereiken, hebben de andere fracties mede gekweekte endotheliale cellen met target cellen22,23,24 en veroorzaakte de differentiatie van pluripotente cellen in CD31-positieve cellen20. De gerapporteerde vaartuig-achtige structuren hoeft echter niet de open uiteinden van de lumina zuurstof en voedingsstoffen naar het midden van de sferoïde te verstrekken. Om na te bootsen de vasculaire functie voeden cellen in de driedimensionale cultuur, moet open en perfusable vasculaire netwerk worden ontwikkeld in de sferoïde.
Tijdens de afgelopen jaren gemeld sommige onderzoeksgroepen op het gebied van microengineering methoden voor de bouw van een perfusable vasculaire netwerk, spontaan gevormd in een microfluidic-apparaat met behulp van angiogenic factoren uit cocultured fibroblast cellen25 ,26. Deze vasculaire netwerken hebben een soortgelijke morfologie aan hun tegenhangers in vivo en kunnen worden vernieuwd door milieufactoren, waardoor ze geschikt voor het nabootsen van vasculaire functies in een sferoïde cultuur. Het doel van dit protocol is voor de bouw van een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde met behulp van een microfluidic platform27. Het microfluidic-apparaat is uit de eerder gemelde apparaat25 gewijzigd, zodat een sferoïde kan worden opgenomen. Door de leiding van de secretie van de angiogenic van de cellen van de fibroblast in een sferoïde naar endotheliale cellen in microchannels, angiogenic spruiten van de microchannels anastomosed met de sferoïde en vormde een perfusable vasculaire netwerk. Met deze methode kunt een directe levering van een breed scala van stoffen, zoals TL moleculen en micrometer-schaal kralen in het interieur van een sferoïde, die het kader voor een lange termijn weefselkweek met vasculaire netwerken vormt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere verslagen blijkt dat hLFs een cocktail van meerdere angiogenic factoren, zoals de angiopoietin-1, de angiogenin, de hepatocyte groeifactor afscheiden, transformeren groeifactor-α, tumor necrose factor en sommige extracellulaire matrix eiwitten29, 30. Deze bepaling is afhankelijk van de secretie van de angiogenic van hLFs in een sferoïde coculture, dat de beperking van de techniek is. Het is daarom essentieel voor een stabiele vasculaire formatie een sf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door CREST JST (subsidie nummer JPMJCR14W4), maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI (subsidie nummer 25600060, 16K 16386), het centrum van innovatie programma van MEXT en JST, Project gericht op de ontwikkeling van Key evaluatie technologie van Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED, Mizuho Stichting ter bevordering van de wetenschappen. Microfabrication werd gesteund door de Kyoto Universiteit Nano technologie-Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
