Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät
Summary
Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.
Abstract
Ein Sphäroid (vielzelligen Aggregat) gilt als ein gutes Modell der lebende Gewebe im menschlichen Körper. Trotz der erheblichen Fortschritt in der Sphäroid Kulturen bleibt ein perfusable Kreislauf Netzwerk in die Sphäroide eine entscheidende Herausforderung für langfristige Kultur zu pflegen und entwickeln ihre Funktionen, wie z. B. Protein ausdrücken und Morphogenese erforderlich. Das Protokoll stellt eine neuartige Methode um ein perfusable Kreislauf Netzwerk innerhalb der Sphäroid in einem mikrofluidischen Gerät zu integrieren. Um ein perfusable Kreislauf Netzwerk in den Sphäroid induzieren, wurden angiogenen Sprossen mit Mikrokanälen verbunden zu den Sphäroid geführt, durch die Verwendung von angiogenen Faktoren von menschlichen Lunge Fibroblasten in der Sphäroid kultiviert. Die Angiogenese Sprossen erreicht das Sphäroid, fusionierte mit der Endothelzellen Co kultiviert in den Sphäroid und einem kontinuierlichen Kreislauf Netzwerk gebildet. Die vaskuläre Netzwerk könnte das Innere der Sphäroid ohne Undichtigkeiten durchspülen. Das konstruierte vaskuläre Netzwerk kann als Route für die Versorgung mit Nährstoffen und Ableitung von Abfallstoffen, imitiert Blutzirkulation in Vivoweiterverwendet werden. Die Methode bietet eine neue Plattform in der Sphäroid Kultur in Richtung bessere Reprise des lebenden Gewebes.
Introduction
Verlagerung von einer monomolekularen Film (zweidimensional) Kultur zu einer dreidimensionalen Kultur ist motiviert durch die Notwendigkeit, mit Kultur-Modellen arbeiten, die die Zellfunktionen des Lebens imitieren Gewebe1,2,3. Die meisten der extrazellulären Umgebungen im menschlichen Körper ähneln flach und harte Kunststoffsubstraten häufig benutzt in der Zellkultur nicht. In der Tat, belegen viele Studien, dass dreidimensionale Kultur neu gewebespezifischen Architektur, mechanischen und biochemischen Signale und Zell-Zell-Kommunikation, die nicht in herkömmlichen zweidimensionalen Kultur4beobachtet wurden, 5,6,7,8.
Eine mehrzelligen Aggregat oder Sphäroid, ist eine der vielversprechendsten Techniken, um diese dreidimensionale Kultur9,10zu realisieren. Zellen sezernieren die extrazelluläre Matrix (ECM) und können mit anderen in der Sphäroid interagieren. Obwohl einige andere Bioengineering nähert sich11,12,13,14, wie Zelle stapeln, erfolgreich replizieren räumliche Komplexität des menschlichen Körpers, diese Ansätze haben nur zwei oder drei Arten von Zellen für die einfache Analyse und konzentrierte sich auf nur eine Funktion der Zielorgane. Im Gegensatz dazu sind andere Kultur Umgebungen je nach ihrer Position in der Sphäroid aufgrund der heterogenen Zufuhr von Nährstoffen, Sauerstoff, und parakrine und autokrine Signalmoleküle in den Sphäroid Zellen in Sphäroide ausgesetzt. Diese Funktion der Sphäroide imitiert teilweise in Vivo Kultur Zustand und aktivieren die Zellen in Sphäroide erstelle ich sehr viel komplexer, organisierte Gewebe in Vitro als kultiviert in Stapeln Gewebe9, Struktur 15 , 16. beachten Sie, dass wenn ein Sphäroid aus einer einzigen Art von Zellen besteht, die Funktion der Zellen in den Sphäroid nicht aufgrund der heterogenen Umgebung in den Sphäroid einheitlich ist. In den letzten Jahren erlaubt Sphäroid Kulturen embryonale Stammzellen (WSR), induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) oder Gewebe-Resident Stammzellen in Vivo Entwicklungsstörungen Sequenzen zu imitieren und neu erstellen Mini-Organe wie das Gehirn17, Leber18und Niere19,20.
Trotz der erheblichen Fortschritte in Sphäroid Kulturtechniken ist die Kultivierung großer Sphäroide schon seit längerem nach wie vor problematisch. Zellen müssen in einem dreidimensionalen Gewebe innerhalb 150-200 µm eines Blutgefäßes aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen21befinden. Vaskulärer Netzwerke innerhalb der Sphäroid sind notwendig, um den Austausch von Stoffen zwischen Blut und Gewebe in Vivozu rekapitulieren. Um dies zu erreichen, haben andere Gruppen Co kultivierten Endothelzellen mit Ziel Zellen22,23,24 oder induziert die Differenzierung von pluripotenten Zellen in CD31-positiven Zellen20. Die gemeldeten Schiff-ähnliche Strukturen haben jedoch nicht die offenen Enden der Lumina, Sauerstoff und Nährstoffe in die Mitte des Sphäroids zu liefern. Um die vaskuläre Rolle um Zellen in der dreidimensionalen Kultur nähren zu imitieren, muss ergebnisoffen und perfusable vaskuläre Netzwerk der Sphäroid entwickelt werden.
In den vergangenen Jahren berichteten einige Forschungsgruppen im Feld Microengineering Methoden, um ein perfusable Kreislauf Netzwerk, spontan gebildet in einem mikrofluidischen Gerät durch die Verwendung von angiogenen Faktoren von cocultured Fibroblastenzellen25 zu bauen ,26. Dieser Kreislauf Netzwerke haben eine ähnliche Morphologie Pendants in Vivo und können durch Umweltfaktoren, eignen sich für die Nachahmung vaskulärer Funktionen in ein Sphäroid Kultur umgebaut werden. Dieses Protokoll soll ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid mit einem mikrofluidischen Plattform27zu bauen. Mikrofluidische Gerät ist von den zuvor gemeldeten Gerät25 geändert, so dass ein Sphäroid integriert werden kann. Durch die Leitung der angiogenen Sekret Fibroblastenzellen in ein Sphäroid an Endothelzellen in Mikrokanälen, angiogenen Sprossen aus der Mikrokanäle anastomosieren mit den Sphäroid und bildeten ein perfusable Kreislauf Netzwerk. Diese Methode ermöglicht eine direkte Lieferung einer breiten Palette von Substanzen, wie fluoreszierende Moleküle und Mikrometer-Skala Perlen ins Innere des ein Sphäroid, die den Rahmen für eine langfristige Gewebekultur mit vaskulären Netzwerken bietet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Berichten zufolge hLFs einen Cocktail aus mehreren angiogenen Faktoren wie Angiopoietin-1, Angiogenin, Hepatozyten-Wachstumsfaktor, Umwandlung von Wachstumsfaktor-α, Tumor-Nekrose-Faktor und einige extrazelluläre Matrix Proteine29absondern, 30. Dieser Assay stützt sich auf die Angiogenese-Sekretion von hLFs in ein Coculture-Sphäroid, die die Einschränkung der Technik ist. Daher ist es wichtig für eine stabile vaskulären Bildung ein Sphäroid Cocu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von CREST JST (Grant-Nummer JPMJCR14W4), Gesellschaft für die Förderung von Science (JSPS) KAKENHI (Grant-Nummer 25600060, 16 K 16386), Center Innovation Program von MEXT und JST, Projekt konzentrierte sich auf Entwicklung Bewertung Schlüsseltechnologie aus unterstützt. Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED, Mizuho-Stiftung zur Förderung der Wissenschaften. Microfabrication wurde von Kyoto Universität Nano Technologiezentrum unterstützt.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
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