רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic
Summary
הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.
Abstract
ספרואיד (צבירה multicellular) נחשב מודל של חיים רקמות בגוף האדם. למרות קידום משמעותי בתרבויות ספרואיד, רשת כלי הדם perfusable ב spheroids עדיין אתגר קריטי לתרבות לטווח ארוך נדרש לשמור ולפתח את הפונקציות שלהם, כגון חלבון ביטויים מורפוגנזה. הפרוטוקול מציג שיטה להשתלב רשת כלי הדם perfusable בתוך ספרואיד התקן microfluidic. כדי לגרום לרשת כלי הדם perfusable ספרואיד, הונחו נבטים האנגיוגנזה מחובר microchannels כדי ספרואיד ניצול גורמי אנגיוגנזה של אמבריולוגיה fibroblasts תרבותי ב ספרואיד. נבטים האנגיוגנזה הגיעו ספרואיד, התמזגה עם תאי אנדותל ותרבותית משותפת ב- ספרואיד, ויצרו רשת כלי דם רציפה. רשת כלי הדם יכול perfuse את הפנים של ספרואיד ללא דליפה כלשהי. נבנה לרשת כלי הדם ניתן להשתמש עוד יותר עבור אספקה של חומרים מזינים והסרה של חומרי פסולת, מחקה את זרימת הדם בתוך vivoכמו מסלול. השיטה מספקת פלטפורמה חדשה בתרבות ספרואיד לכיוון נעלה יותר של רקמות החי.
Introduction
המעבר בין תרבות (דו מימדי) חד שכבתי לתרבות תלת מימדי מונע ע י צורך לעבוד עם מודלים תרבות המחקים את הפונקציות הסלולר של חיים רקמות1,2,3. מצעים פלסטיק שטוחה וקשה נפוץ תרבית תאים לא דומים ביותר של סביבות חוץ-תאית בגוף האדם. למעשה, מחקרים רבים להפגין ארכיטקטורה תלת מימדי התרבות הזו של רקמות ספציפיות לשחזר מכני וביוכימי רמזים, תקשורת, אשר לא נצפו תרבות דו מימדי קונבנציונאלי4, 5,–6,–7,–8.
צבירה multicellular ספרואיד, הוא אחד של טכניקות המבטיחים ביותר להבין זה תלת מימדי התרבות9,10. התאים המפרישים את מטריצה חוץ-תאית (ECM), יכולים לקיים אינטראקציה עם אחרים ספרואיד. למרות כמה אחרים בביו-הנדסה מתקרב11,12,13,14, כגון תא בערימה, בהצלחה לשכפל את המורכבות המרחבי של הגוף האנושי, הגישות הללו יש רק שניים או שלושה סוגים של תאים עבור להקל על ניתוח ממוקד רק תפקיד אחד של אברי המטרה. לעומת זאת, תאים spheroids חשופים לסביבות תרבות שונים בהתאם עמדותיהם ספרואיד בשל הטרוגניות אספקת חומרים מזינים, חמצן, ואת paracrine autocrine מולקולות ב ספרואיד איתות. תכונה זו של spheroids מחקה באופן חלקי ויוו תרבות תנאי, ומאפשרים התאים spheroids ליצירת רקמות מורכבים הרבה יותר, מאורגנת מבנה במבחנה מאלה תרבותי הערימה רקמות9, 15 , 16. הערה אם ספרואיד מורכבת מסוג אחד של תאים, תפקוד התאים ספרואיד אינו אחיד עקב בסביבה הטרוגנית ספרואיד. בשנים האחרונות, ספרואיד תרבויות מותר בתאי גזע pluripotent בתאי גזע עובריים (ESCs), המושרה (iPSCs) או בתאי גזע רקמות תושב לחקות ויוו רצפים התפתחותיים ואף ליצור מיני-איברים כגון המוח17, הכבד18ו כליות19,20.
למרות התקדמות משמעותית בשיטות תרבות ספרואיד, culturing spheroids גדול במשך זמן רב הוא עדיין בעייתי. טישו תלת מימדי, תאים צריך להיות ממוקם בתוך 150-200 מיקרומטר של כלי דם בגלל אספקת חמצן וחומרים מזינים21מוגבלת. רשתות כלי דם בתוך ספרואיד נחוצים לסכם החלפת חומרים בין הדם ורקמות בתוך vivo. כדי להשיג זאת, קבוצות אחרות משותף תרבותי תאי אנדותל עם היעד תאים22,23,24 או המושרה את הבידול של תאים pluripotent לתוך תאים CD31-חיוביות20. ובכל זאת, המבנים כלי דמוי דווח על אין סוף פתוח לומינה לאספקת חמצן וחומרים מזינים למרכז ספרואיד. כדי לחקות את תפקיד כלי הדם לטפח תאים בתרבות תלת מימדי, פתוח, perfusable רשת כלי הדם חייב להיות שפותחה ב- ספרואיד.
במהלך השנים האחרונות, כמה קבוצות מחקר בתחום microengineering דיווח שיטות לבנות רשת כלי דם perfusable, באופן ספונטני הנוצרת במכשיר microfluidic על-ידי ניצול גורמי אנגיוגנזה מתאי פיברובלסט cocultured25 ,26. רשתות אלה כלי הדם יש של המורפולוגיה דומה לכלים המקבילים ויוו , יכול להיות שופצה על ידי גורמים סביבתיים, שהופך אותם למתאימים עבור מחקה פונקציות וסקולרית בתרבות ספרואיד. המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד באמצעות פלטפורמה של microfluidic27. המכשיר microfluidic הוא שונה התקן שדווחה בעבר25 כך ספרואיד ניתן לשלב. על ידי הפניית הפרשה אנגיוגנזה של תאי פיברובלסט ספרואיד לתאי אנדותל של microchannels, האנגיוגנזה נבטים של microchannels את anastomosed עם ספרואיד ויצרו רשת כלי הדם perfusable. שיטה זו מאפשרת משלוח ישיר של מגוון רחב של חומרים, כגון פלורסנט מולקולות וחרוזים מיקרומטר-סולם אל פנים ספרואיד, אשר מספקת את המסגרת תרביות רקמה לטווח ארוך עם רשתות כלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
דיווחים קודמים מראים כי hLFs מפרישים קוקטייל של מספר גורמי אנגיוגנזה, angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte פקטורי גדילה, שינוי צורה של גורם גדילה-α, הגידול נקרוזה מקדם, כמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים29, 30. Assay הזה מסתמך על הפרשה האנגיוגנזה מ hLFs ב ספרואיד coculture, אשר הוא המגבלה של הט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרסט JST (גרנט מספר JPMJCR14W4), החברה עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI (גרנט מספר 25600060, 16K 16386), מרכז של חדשנות תוכנית MEXT, JST, התמקד בפיתוח טכנולוגיה הערכה מפתח מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED, Mizuho קרן לקידום מדעי. מיקרו-מלאכותית נתמכה על ידי אוניברסיטת קיוטו ננו טכנולוגיה Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
