Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico
Summary
Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l’angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.
Abstract
Uno sferoide (un aggregato pluricellulare) è considerato come un buon modello di tessuti viventi nel corpo umano. Nonostante il progresso significativo nelle culture sferoide, una rete vascolare perfusable in sferoidi rimane una sfida critica per coltura a lungo termine necessario per mantenere e sviluppare le loro funzioni, come espressioni della proteina e la morfogenesi. Il protocollo presenta un nuovo metodo per integrare una rete vascolare perfusable all’interno della sferoide in un dispositivo microfluidico. Per indurre una rete vascolare perfusable nella sferoide, germogli angiogenici collegati a microcanali sono stati guidati per la sferoide utilizzando fattori angiogenici da fibroblasti polmonari umane coltivate nella sferoide. I germogli angiogenici raggiunto sferoide, che si fuse con le cellule endoteliali co-coltivate in sferoide e formano una rete vascolare continua. La rete vascolare potrebbe irrorare l’interno della sferoide senza alcuna perdita. La rete vascolare costruita può essere utilizzata ulteriormente come un itinerario per rifornimento delle sostanze nutrienti e la rimozione dei prodotti di scarto, che imita il sangue circolazione in vivo. Il metodo fornisce una nuova piattaforma nella cultura di sferoide verso migliore ricapitolazione dei tessuti viventi.
Introduction
Passaggio da una cultura (bidimensionale) monostrato a una cultura tridimensionale è motivato dalla necessità di lavorare con modelli di cultura che imitano le funzioni cellulari di vivere tessuti1,2,3. Piatti e rigidi substrati plastici comunemente usati nella coltura delle cellule non assomigliano a maggior parte degli ambienti extracellulare nel corpo umano. Infatti, molti studi dimostrano che cultura tridimensionale ricrea tessuto-specifica architettura, meccanici e biochimici spunti e comunicazione cellula-cellula, che non sono state osservate in coltura convenzionale bidimensionale4, 5,6,7,8.
Un aggregato pluricellulare o sferoide, è una delle tecniche più promettenti per rendersi conto di questa cultura tridimensionale9,10. Le cellule secernono la matrice extracellulare (ECM) e possono interagire con altri utenti la sferoide. Anche se alcuni altri bioingegneria si avvicina13,12,11,14, come cellula di impilamento, replicare con successo la complessità spaziale del corpo umano, questi approcci hanno solo due o tre tipi di cellule per la facilità di analisi e concentrato sulla sola funzione di organi bersaglio. Al contrario, le cellule in sferoidi sono esposte agli ambienti di cultura diversa a seconda delle loro posizioni in sferoide dovuto il rifornimento eterogeneo di nutrienti, ossigeno e paracrini e autocrini segnalando le molecole nella sferoide. Questa caratteristica di sferoidi imita parzialmente in vivo condizione cultura e attiva le cellule in sferoidi a creare tessuti molto più complesso, organizzato struttura in vitro rispetto a quelle coltivate in sovrapposizione tessuto9, 15 , 16. si noti che se uno sferoide è costituito da un solo tipo di cellule, la funzione delle cellule nella sferoide non è uniforme a causa dell’ambiente eterogeneo nella sferoide. Negli ultimi anni, culture sferoide ammessi cellule staminali embrionali (ESC), ha indotte le cellule staminali pluripotenti (iPSCs) o cellule staminali tessuto-residente di imitare in vivo dello sviluppo sequenze e ricreare mini-organi come il cervello17, del fegato del rene e1819,20.
Nonostante i significativi progressi nelle tecniche di cultura sferoide, coltura sferoidi grande per lungo tempo è ancora problematica. In un tessuto tridimensionale, le cellule hanno bisogno di trovarsi all’interno di 150-200 µm di un vaso sanguigno a causa della quantità limitata di ossigeno e sostanze nutritive21. Reti vascolari all’interno della sferoide sono necessari per lo scambio di sostanze tra sangue e tessuti in vivodi ricapitolare. Per raggiungere questo obiettivo, altri gruppi hanno co-colture di cellule endoteliali con destinazione cellule22,23,24 o indotto la differenziazione delle cellule pluripotenti in CD31-positivo cellule20. Tuttavia, le strutture di vaso-come riferite non hanno le estremità aperte del lumina di fornire ossigeno e sostanze nutritive per il centro della sferoide. Per simulare il ruolo vascolare per nutrire le cellule nella cultura tridimensionale, a tempo indeterminato e perfusable rete vascolare deve essere sviluppato nella sferoide.
Durante gli ultimi anni, alcuni gruppi di ricerca nel campo Microtecnica riportati metodi per costruire una rete vascolare perfusable, formata spontaneamente in un dispositivo microfluidico utilizzando fattori angiogenici dalle cellule del fibroblasto cocultured25 ,26. Queste reti vascolari hanno una morfologia simile alle loro controparti in vivo e possono essere ristrutturate da fattori ambientali, che li rende adatti per mimare le funzioni vascolari in una cultura di sferoide. Lo scopo del presente protocollo è quello di costruire una rete vascolare perfusable in uno sferoide utilizzando una piattaforma di microfluidica27. Il dispositivo microfluidico è modificato dal dispositivo precedentemente segnalati25 in modo che può essere incorporato uno sferoide. Indirizzando la secrezione angiogenici dalle cellule del fibroblasto in uno sferoide alle cellule endoteliali a microcanali, angiogenico germogli da microcanali anastomizzato con la sferoide e formato una rete vascolare perfusable. Questo metodo permette una consegna diretta di una vasta gamma di sostanze, quali molecole fluorescenti e perline di micrometro-scala all’interno di uno sferoide, che fornisce il quadro per una coltura a lungo termine del tessuto con reti vascolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
I rapporti precedenti mostrano che hLFs secernono un cocktail di più fattori angiogenici, quali angiopoietina-1, angiogenina, fattore di crescita dell’epatocita, trasformando la crescita fattore-α, il fattore di necrosi tumorale e alcune proteine di matrice extracellulare29, 30. Questo test si basa sulla secrezione angiogenica da hLFs in uno sferoide coculture, che è la limitazione della tecnica. Pertanto, è fondamentale per una formazione vascolare stabile …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla cresta JST (concessione numero JPMJCR14W4), società per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI (codice di autorizzazione 25600060, 16K 16386), il centro di innovazione programma dal MEXT e JST, progetto incentrato su sviluppo di tecnologia chiave valutazione da Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo, AMED, Mizuho Fondazione per la promozione delle scienze. Microfabbricazione è stata sostenuta da Kyoto University Nano tecnologia Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
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