Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic
Summary
O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.
Abstract
Um esferoide (um agregado multicelular) é considerado como um bom modelo de tecidos vivos no corpo humano. Apesar do avanço significativo nas culturas esferoide, uma rede vascular perfusable nos esferoides permanece um desafio crítico para a cultura a longo prazo, necessário para manter e desenvolver as suas funções, tais como expressões de proteína e morfogênese. O protocolo apresenta um novo método para integrar uma rede vascular perfusable dentro o spheroid em um dispositivo microfluidic. Para induzir uma rede vascular perfusable no spheroid, brotos de angiogênico ligados ao microcanais foram guiados para o spheroid utilizando angiogênico fatores de fibroblastos de pulmão humano cultivados no spheroid. Os brotos angiogênico alcançou o spheroid, fundiu-se com as células endoteliais co cultivadas no spheroid e formaram uma rede vascular contínua. A rede vascular poderia perfundir o interior o spheroid sem quaisquer fugas. A rede vascular construída pode ser mais usada como uma rota para o fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos de produtos, imitando a circulação de sangue vivo em. O método fornece uma plataforma nova em cultura de esferoide em direção a melhor recapitulação dos tecidos vivos.
Introduction
Mudando de uma cultura de monocamada (bidimensional) para uma cultura tridimensional é motivada pela necessidade de trabalhar com modelos de cultura que imitam as funções celulares de vida tecidos1,2,3. Substratos de plástico lisos e duro comumente utilizados na cultura de pilha não se assemelham a maioria dos ambientes extracelulares no corpo humano. Na verdade, muitos estudos demonstram que arquitetura de tecido-específica de recriar de cultura tridimensional, pistas mecânicas e bioquímicas e comunicação célula-célula, que não tenham sido observados na cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.
Um agregado multicelular ou esferoide, é uma das técnicas mais promissoras para perceber esta cultura tridimensional9,10. As células secretam a matriz extracelular (ECM) e podem interagir com os outros no spheroid. Embora alguns outra bioengenharia aproxima-se13,11,12,14, tais como célula de empilhamento, replicar com sucesso a complexidade espacial do corpo humano, essas abordagens têm apenas dois ou três tipos de células para a facilidade de análise e focada em apenas uma função de órgãos-alvo. Em contraste, as células em esferoides são expostas a ambientes de cultura diferente, dependendo de suas posições no spheroid devido à oferta heterogênea de nutrientes, oxigênio e parácrina e autócrina sinalização moléculas no spheroid. Esse recurso de esferoides imita parcialmente na vivo condição de cultura e ativar as células em esferoides para criar tecido muito mais complexo, organizado estruturam em vitro do que aquelas cultivadas em empilhamento tecido9, 15 , 16. note que se um esferoide é composto por um único tipo de células, a função das células o spheroid não é uniforme, devido ao ambiente heterogêneo no spheroid. Nos últimos anos, as culturas de esferoide permitido células-tronco pluripotentes células-tronco embrionárias (CES), induzidas (iPSCs) ou células-tronco tecido-residente para imitar na vivo do desenvolvimento sequências e recriar miniórgãos como o cérebro de17, fígado18e rim19,20.
Apesar dos progressos significativos nas técnicas de cultura de esferoide, cultivo esferoides grandes por muito tempo ainda é problemático. Em um tecido tridimensional, células precisam ser localizado dentro de 150-200 µm de um vaso sanguíneo devido a quantidade limitada de oxigênio e nutrientes21. Redes vasculares dentro o spheroid são necessárias para recapitular a troca de substâncias entre o sangue e os tecidos em vivo. Para conseguir isso, outros grupos têm co culto células endoteliais com alvo células22,23,24 ou induziu a diferenciação de células pluripotentes em células de CD31 positivo20. No entanto, as estruturas de embarcação-como relatadas não têm as extremidades abertas da lumina para fornecer oxigênio e nutrientes para o centro do spheroid. Para simular a função vascular para nutrir as células na cultura tridimensional, em aberto e perfusable rede vascular deve ser desenvolvida no spheroid.
Durante os últimos anos, alguns grupos de pesquisa no campo microengineering relataram métodos para construir uma rede vascular perfusable, formada espontaneamente em um dispositivo microfluidic utilizando factores angiogênico das células de fibroblastos cocultured25 ,26. Estas redes vasculares têm uma morfologia semelhante às suas contrapartes na vivo e podem ser remodelados por fatores ambientais, tornando-os adequados para imitar funções vasculares em uma cultura de esferoide. O propósito do presente protocolo é construir uma rede vascular perfusable em um esferoide usando uma plataforma de microfluidic27. O dispositivo microfluidic é modificado o dispositivo anteriormente relatados25 para que um esferoide pode ser incorporado. Direcionando a secreção angiogênico das células de fibroblastos em um esferoide de células endoteliais em microcanais, angiogênico brotos dos microcanais anastomosadas com o spheroid e formou uma rede vascular perfusable. Este método permite uma entrega direta de uma vasta gama de substâncias, tais como moléculas fluorescentes e grânulos de micrômetro-escala para o interior de um esferoide, que fornece o quadro para uma cultura de tecidos de longo prazo com redes vasculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Relatórios anteriores mostram que hLFs secretam um coquetel de fatores angiogênico múltiplos, tais como angiopoietina-1, angiogenin, fator de crescimento de hepatócito, transformando o fator de crescimento-α, fator de necrose tumoral e algumas proteínas da matriz extracelular29, 30. Este ensaio baseia-se na secreção de hLFs em um esferoide coculture, que é a limitação da técnica angiogênico. Portanto, é fundamental para uma formação vascular est?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela crista JST (número de concessão JPMJCR14W4), sociedade para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI (número de concessão 25600060, 16K 16386), o centro de inovação programa do MEXT e JST, projeto focado no desenvolvimento de tecnologia de avaliação de chave de Agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED, Mizuho Fundação para a promoção das Ciências. Microfabrication foi apoiado pela Universidade de Kyoto Nano tecnologia Hub.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
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