Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos
Summary
El protocolo describe cómo diseñar una red vascular perfusable en un esferoide. Microambiente circundante del esferoide es ideado para inducir angiogénesis y conectarse el esferoide de los microcanales en un dispositivo de microfluidos. El método permite la perfusión de la esferoide, que es una técnica largamente esperada en cultivos tridimensionales.
Abstract
Un esferoide (un agregado multicelular) es considerado como un buen modelo de tejidos vivos en el cuerpo humano. A pesar del avance significativo en las culturas del esferoide, una red vascular perfusable en los esferoides sigue siendo un reto para la cultura a largo plazo necesaria para mantener y desarrollar sus funciones, como expresiones de la proteína y la morfogénesis. El protocolo presenta un método novedoso para integrar una red vascular perfusable dentro del esferoide en un dispositivo de microfluidos. Para inducir una red vascular perfusable en el esferoide, brotes angiogénicos conectados con microcanales fueron guiados a la esferoide utilizando factores angiogénicos de fibroblastos de pulmón humanos cultivados en el esferoide. Los brotes angiogénicos alcanzaron el esferoide, que se fusiona con las células endoteliales cultivadas conjuntamente en el esferoide y forman una red vascular continua. La red vascular podría inundar el interior del esferoide sin ninguna salida. La red vascular construida puede utilizarse más como una ruta para el suministro de nutrientes y eliminación de residuos, que mímico la circulación de sangre en vivo. El método proporciona una nueva plataforma en la cultura de esferoide hacia mejor recapitulación de los tejidos vivos.
Introduction
El cambio de una cultura (bidimensional) de monocapa a una cultura tridimensional está motivado por la necesidad de trabajar con modelos de cultura que imitan las funciones celulares de la vida los tejidos1,2,3. Planos y duros plástico sustratos utilizados en cultivo de células no se parecen a la mayoría de los entornos extracelulares en el cuerpo humano. De hecho, muchos estudios demuestran que cultura tridimensionales recrear tejidos específicos la arquitectura, señales mecánicas y bioquímicas y comunicación de la célula, que no se han observado en la cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.
Un agregado multicelular o esferoide, es una de las técnicas más prometedoras para realizar este cultivo tridimensional9,10. Las células secretan la matriz extracelular (ECM) y pueden interactuar con otros en el esferoide. Aunque algunos otros bioingeniería enfoques11,12,13,14, como el amontonamiento de células, replicar con éxito la complejidad espacial del cuerpo humano, estos enfoques tienen sólo dos o tres tipos de células para la facilidad de análisis y enfocada en sólo una de las funciones de órganos diana. En contraste, las células esferoides están expuestas a ambientes de cultivo diferentes dependiendo de sus posiciones en el esferoide debido a la heterogénea oferta de nutrientes, oxígeno y paracrina y autocrina señalización de moléculas en el esferoide. Esta característica de esferoides imita parcialmente en vivo cultura condición y activar las células esferoides para crear tejido mucho más complejo y organizado de la estructura en vitro que las cultivadas en el apilamiento de tejido9, 15 , 16. tenga en cuenta que si un esferoide se compone de un solo tipo de células, la función de las células en el esferoide no es uniforme debido al ambiente heterogéneo en el esferoide. En los últimos años, las culturas esferoide permitieron células de madre pluripotentes células madre embrionarias (ESCs), inducidas (iPSCs) o células madre de tejido-residente en vivo secuencias de desarrollo de imitar y recrear mini-órganos como el cerebro17, hígado18y riñón19,20.
A pesar de importantes avances en las técnicas de cultivo esferoide, cultivo esferoides grandes durante mucho tiempo es todavía problemático. En un tejido tridimensional, las células necesitan estar ubicados a menos de 150-200 μm de un vaso sanguíneo debido a la limitada fuente de oxígeno y nutrientes21. Redes vasculares en el esferoide están necesarias recapitular intercambiando sustancias entre la sangre y los tejidos in vivo. Para ello, otros grupos han co cultivadas las células endoteliales con las células de destino22,23,24 o inducido la diferenciación de las células pluripotentes en CD31-positive células20. Sin embargo, las estructuras de recipiente-como informadas no tiene los extremos abiertos del lumina para suministrar oxígeno y nutrientes al centro del esferoide. Para imitar la función vascular para nutrir las células en el cultivo tridimensional, abierta y perfusable de la red vascular debe ser desarrollada en el esferoide.
Durante los últimos años, algunos grupos de investigación en el campo de la Microtécnica informaron métodos para construir una red vascular perfusable, formada espontáneamente en un dispositivo de microfluidos utilizando factores angiogénicos de células de morfología de fibroblastos25 ,26. Estas redes vasculares tienen una morfología similar a sus contrapartes en vivo y pueden ser remodeladas por factores ambientales, haciéndolos convenientes para mímico funciones vasculares en una cultura del esferoide. El propósito de este protocolo es construir una red vascular perfusable en un esferoide usando una plataforma de microfluidos27. El dispositivo de microfluidos se modifica el dispositivo previamente divulgados25 por lo que puede ser incorporado un esferoide. Dirigiendo la secreción angiogénico de las células del fibroblasto de un esferoide a las células endoteliales en microcanales, angiogénica brota de los microcanales que se anastomosa con el esferoide y forma una red vascular perfusable. Este método permite una entrega directa de una amplia gama de sustancias, como las moléculas fluorescentes y granos micrómetro-escala en el interior de un esferoide, que proporciona el marco para un cultivo de tejidos a largo plazo con las redes vasculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Informes anteriores muestran que hLFs secretan un cóctel de varios factores angiogénicos, como angiopoyetina-1, angiogenina, factor de crecimiento, transformación de factor de crecimiento-α, factor de necrosis tumoral y algunas de las proteínas de matriz extracelular29, 30. Este ensayo se basa en la secreción de angiogenic del hLFs en un esferoide de cocultivo, que es la limitación de la técnica. Por lo tanto, es fundamental para una formación vascular …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por cresta JST (número JPMJCR14W4), sociedad para la promoción de la ciencia (JSP) KAKENHI (número de concesión 25600060, 16 16386 K), el centro de innovación programa de MEXT y TJS, se centró en el desarrollo de la tecnología de clave evaluación de Agencia de Japón para investigación médica y el desarrollo, AMED, Mizuho Fundación para el fomento de las ciencias. Microfabricación fue apoyado por el centro de tecnología de Nano de la Universidad de Kyoto.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
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