Perfusable vaskulär nätverk med en vävnad modell i en mikroflödessystem enhet
Summary
Protokollet beskrivs hur man ingenjör en perfusable vaskulär nätverk i en sfäroid. Den sfäroid omgivande närmiljön är utarbetat för att inducera angiogenes och ansluta sfäroid till mikrokanaler i en mikroflödessystem enhet. Metoden tillåter perfusionen i den sfäroid, vilket är en efterlängtad teknik i tredimensionella kulturer.
Abstract
En sfäroid (en flercelliga aggregat) betraktas som en bra modell av levande vävnader i människokroppen. Trots betydande framsteg inom sfäroid kulturerna förblir ett perfusable vaskulär nätverk i spheroids en viktig utmaning för långtidsodling som krävs för att upprätthålla och utveckla deras funktioner, såsom protein uttryck och morfogenes. Protokollet presenterar en ny metod för att integrera en perfusable vaskulär nätverk inom sfäroid i en mikroflödessystem enhet. För att framkalla en perfusable vaskulär nätverk i sfäroid, vägleddes angiogena groddar ansluten till mikrokanaler till sfäroid genom att utnyttja angiogena från humana lungfibroblaster odlade i sfäroid. Angiogena groddarna nådde den sfäroid, samman med endotelceller Co odlade i sfäroid, och bildade en kontinuerlig vaskulär nätverk. Vaskulära nätverket kunde BEGJUTA interiören sfäroid utan läckage. Det konstruerade vaskulär nätverket kan användas ytterligare som en rutt för tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av slaggprodukter, härma blodcirkulationen i vivo. Metoden ger en ny plattform i sfäroid kultur mot bättre rekapitulation av levande vävnader.
Introduction
Skifta från en enskiktslager (tvådimensionell) kultur till en tredimensionell kultur motiveras av behovet av att arbeta med kultur modeller som efterliknar de cellulära funktionerna levande vävnader1,2,3. Platt och hård plast substrat som vanligen används i cellkultur liknar inte de flesta av de extracellulära miljöerna i den mänskliga kroppen. I själva verket visar många studier att tredimensionella kultur återskapa vävnadsspecifika arkitektur, mekaniska och biokemiska signaler och cell-cell kommunikation, som inte har iakttagits i konventionella tvådimensionell kultur4, 5,6,7,8.
En flercelliga aggregat eller sfäroid, är en av de mest lovande teknikerna för att förverkliga denna tredimensionella kultur9,10. Celler utsöndrar den extracellulär matrixen (ECM) och kan interagera med andra i sfäroid. Även om vissa andra bioengineering närmar sig11,12,13,14, såsom cell stapling, replikera framgångsrikt rumsliga komplexiteten i den mänskliga kroppen, dessa metoder har bara två eller tre typer av celler för enkel analys och fokus på bara en funktion av målorgan. Celler i spheroids utsätts däremot för olika kultur miljöer beroende på sina positioner i sfäroid på grund av heterogena leverans av näringsämnen, syre, och parakrin och autokrin signalmolekyler i sfäroid. Denna funktion av spheroids härmar delvis i vivo kultur skick och aktivera cellerna i spheroids att skapa mycket mer komplex, organiserad vävnad struktur i vitro än de odlade i stapling vävnad9, 15 , 16. om en sfäroid består av en enda typ av celler, funktionen av cellerna i sfäroid är inte enhetlig på grund av heterogena miljö i sfäroid. I de senaste åren, sfäroid kulturer får embryonala stamceller (EKSG), inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) eller vävnad boförälder stamceller att efterlikna i vivo utvecklingsmässiga sekvenser och återskapa mini-organ såsom hjärna17, lever18och njure19,20.
Trots betydande framsteg i sfäroid kultur tekniker är odla stora spheroids under lång tid fortfarande problematiskt. I en tredimensionell vävnad behöver celler vara ligger inom 150-200 µm av ett blodkärl på grund av det begränsade utbudet av syre och näringsämnen21. Vaskulär nätverk inom sfäroid är nödvändigt att sammanfatta utbyte av ämnen mellan blod och vävnader i vivo. För att uppnå detta, har andra grupper tillsammans odlade endotelceller med målet celler22,23,24 eller inducerad differentiering av pluripotenta celler in CD31-positiva celler20. De rapportera fartyget-liknande strukturerna har dock inte de öppna ändarna på lumina att leverera syre och näringsämnen till mitten av sfäroid. För att efterlikna den vaskulära rollen för att ge näring till cellerna i den tredimensionella kulturen, måste öppen och perfusable vaskulär nätverk utvecklas i sfäroid.
Under de senaste åren, vissa forskargrupper i fältet microengineering rapporterade metoder att konstruera en perfusable vaskulär nätverk, spontant bildade en mikroflödessystem enhet genom att utnyttja angiogena från cocultured fibroblast celler25 ,26. Dessa vaskulära nätverk har en liknande morfologi till motsvarigheterna i vivo och kan vara ombyggda av miljöfaktorer, vilket gör dem lämpliga för att imitera vaskulär funktioner i en sfäroid kultur. Syftet med detta protokoll är att konstruera en perfusable vaskulär nätverk i en sfäroid använder en mikroflödessystem plattform27. Mikroflödessystem enheten ändras från de tidigare rapporterade enhet25 så att en sfäroid kan införlivas. Genom att rikta angiogena utsöndringen från fibroblast celler i en sfäroid till endotelceller i mikrokanaler, angiogena groddar från den mikrokanaler anastomoseras med sfäroid och bildade en perfusable vaskulär nätverk. Denna metod tillåter en direkt leverans av ett brett spektrum av ämnen, såsom fluorescerande molekyler och mikrometer-skala pärlor i inre av en sfäroid, som ger en ram för ett långsiktigt vävnadsodling med vaskulär nätverk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare rapporter visar att hLFs utsöndrar en cocktail av flera angiogena faktorer, såsom angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte tillväxtfaktor, omvandla tillväxt factor-α, tumör nekros faktor och vissa extracellulära matrix proteiner29, 30. Denna analys bygger på angiogena utsöndringen från hLFs i en coculture sfäroid, som är begränsningen av tekniken. Därför är det avgörande för en stabil vaskulär formation att ställa en coculture sfäroid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av CREST JST (licensnummer JPMJCR14W4), samhället för det främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI (licensnummer 25600060, 16K 16386), The Center of Innovation Program från MEXT och JST, projektet inriktat på att utveckla nyckel utvärdering teknik från Japan-byrå för medicinsk forskning och utveckling, AMED, Mizuho stiftelse för främjande av vetenskaper. Mikrofabrikation stöddes av Kyoto universitet Nano teknik navet.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
