Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt
Summary
Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel’ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.
Abstract
Bir küresel (çok hücreli agrega) insan vücudunun içinde yaşayan doku iyi bir model olarak kabul edilir. Küresel kültürler içinde önemli ilerleme rağmen pulcuklarının perfusable vasküler ağlarda korumak ve protein ifadeler ve morfogenetik gibi işlevlerini geliştirmek için gerekli uzun vadeli kültür için kritik bir meydan okuma kalır. Protokol perfusable bir damar ağı içinde küresel bir mikrosıvısal cihazın entegre etmek için yeni bir yöntem sunuyor. Küresel perfusable vasküler ağlarda ikna etmek için mikro için bağlı anjiogenik lahanası için küresel anjiogenik faktörler küresel kültürlü insan akciğer fibroblastlar üzerinden kullanarak destekli. Anjiogenik lahanası küresel işbirliği kültürlü endotel hücreleri ile birleştirilmiş küresel ulaştı ve sürekli bir damar ağı kurdu. Vasküler ağ olmadan herhangi bir küresel iç sıvı. İnşa vasküler ağ daha fazla besin temini ve atık ürünlerin, kan dolaşımını içinde vivotaklit kaldırılması için bir yol olarak kullanılabilir. Yöntemi küresel kültür yaşam dokuların daha iyi Rekapitülasyon doğru yeni bir platform sağlar.
Introduction
Üç boyutlu bir kültüre monolayer (iki boyutlu) kültüründen değişen motive yaşayan hücresel işlevlerini taklit kültür modelleri ile çalışması gerektiğinden dokular1,2,3. Düz ve sert plastik yüzeylerde yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe insan vücudu hücre dışı ortamlarda çoğu benzer değil. Aslında, birçok çalışma o üç boyutlu kültür yeniden doku özgü mimari, mekanik ve biyokimyasal ipuçları ve hücre-hücre iletişim, geleneksel iki boyutlu kültür4‘ tegözlenen değil göstermek, 5,6,7,8.
Bir çok hücreli agrega veya küresel, bir bu üç boyutlu kültür9,10gerçekleştirmek için en umut verici teknikleri biridir. Hücreleri hücre dışı Matriks (ECM) salgılar ve diğerleri ile küresel etkileşim kurabilir. Her ne kadar bazı diğer Biyomühendislik gibi hücre istifleme,11,12,13,14, yaklaşımlar başarıyla insan vücudunun kayma karmaşıklık çoğaltmak, yalnızca iki veya üç bu yaklaşımlar var hücreler analiz kolaylığı ve hedef organlar üzerinde duruldu yalnızca bir işlev için türlü. Buna ek olarak, pulcuklarının hücrelerde besinler, oksijen ve parakrin ve küresel olarak sinyal otokrin heterojen temini nedeniyle küresel konumlarına bağlı olarak farklı kültür ortamlara maruz kalır. Bu özelliği pulcuklarının, kısmen vivo içinde kültür durumu ve olanaklı kılmak çok daha karmaşık, organize doku oluşturmak için pulcuklarının hücrelerde vitro bu yığın doku9‘, kültürlü yapısı taklit eder 15 , 16. bir küresel tek bir hücre oluşur, küresel hücrelerde işlevi nedeniyle küresel türdeş olmayan ortamda tek tip olmadığını unutmayın. Son birkaç yıl içinde küresel kültürler embriyonik kök hücreleri (ESCs), indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) veya doku yerleşik kök hücre içinde vivo gelişimsel dizileri taklit ve mini-organ beyin17gibi yeniden girebilir, karaciğer18ve böbrek19,20.
Küresel kültür teknikleri önemli ilerlemeye rağmen hala uzun bir süre için büyük pulcuklarının kültür problemlidir. Üç boyutlu bir doku hücreleri oksijen ve besin21sınırlı kaynağı nedeniyle bir kan damarı 150-200 µm içinde bulunduğu gerekir. Küresel içinde damar ağları arasında kan ve doku içinde vivoalışverişi maddeler özetlemek gereklidir. Bunu başarmak için diğer gruplar endotel hücreleri hedef hücre22,23,24 ile birlikte kültürlü veya pluripotent hücreler farklılaşma CD31 pozitif hücreler20içine indüklenen. Yine de, bildirilen gemi benzeri yapıları lumina oksijen ve besin küresel ortasına sağlamak için açık uçları var mı. Üç boyutlu kültür hücrelerde besleyen damar rol taklit etmek için açık uçlu ve perfusable damar ağı içinde küresel geliştirilmelidir.
Son birkaç yıl içinde bazı araştırma grupları microengineering alanındaki kendiliğinden bir mikrosıvısal cihazda anjiogenik faktörler cocultured fibroblast hücreleri25 kullanarak oluşturduğu bir perfusable vasküler ağ oluşturmak için yöntemleri bildirdi. ,26. Vasküler bu şebekeler için in vivo meslektaşlarına benzer görünümdeki ve vasküler fonksiyonlar bir küresel kültür taklit için uygundur çevresel faktörler tarafından yenilenmiş. Bu iletişim kuralının amacı bir mikrosıvısal platformu27kullanarak bir küresel perfusable vasküler ağlarda oluşturmaktır. Böylece bir küresel dahil edilebilir mikrosıvısal aygıt daha önce bildirilen aygıt25 değiştirilir. Bir küresel fibroblast hücrelerinde üzerinden anjiogenik salgı mikro endotel hücreleri yönlendirerek tarafından anjiogenik ile küresel anastomosed mikro üzerinden lahanası ve perfusable bir damar ağı kurdu. Bu yöntem, floresan molekülleri ve damar ağları ile uzun vadeli bir doku kültürü için çerçeve sağlar bir küresel iç içine mikrometre ölçekli boncuk gibi maddeleri geniş bir doğrudan teslim sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki raporları hLFs angiopoietin-1, angiogenin, hepatosit büyüme faktörü, büyüme faktör-α, tümör nekrozis faktör ve bazı hücre dışı matriks proteinleri29dönüşüm gibi birden çok anjiogenik faktörlerin bir kokteyl salgılar göstermek, 30. Bu tahlil anjiogenik salgı ilgili kısıtlama tekniği, coculture küresel hLFs üzerinden kullanır. Bu nedenle, coculture küresel ve Kanal 1 ve 3 HUVECs arasındaki mesafe kısaltılmış bir kuyunu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser CREST JST (grant sayı JPMJCR14W4), toplum için promosyon, bilim (JSP’ler) KAKENHI (grant sayı 25600060, 16 K 16386), MEXT ve JST, proje anahtar değerlendirme teknoloji geliştirme odaklı yenilik Program Merkezi tarafından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED, Mizuho temel bilimler tanıtımı için Japonya Ajansı. Microfabrication Kyoto Üniversitesi Nano teknoloji Hub tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
