Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen
Summary
We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio’s van neonatale muis hersenen.
Abstract
Veel genen in embryonale hersenen zijn uitgedrukt, en sommigen van hen voortdurend worden uitgedrukt in de hersenen na de geboorte. Voor dergelijke aanhoudend uitgedrukte genen werken ze voor het regelen van de ontwikkelingstoxiciteit proces en/of de fysiologische functie in neonatale hersenen. Om te onderzoeken neurobiologische functies van specifieke genen in de hersenen, is het essentieel om de inactivering van genen in de hersenen. Hier beschrijven we een eenvoudige stereotaxic methode om de inactivering van genexpressie in het striatum van transgene muizen op neonatale tijd windows. AAV-eGFP-Cre virussen werden microinjected in het striatum van Ai14 reporter gene muizen op postnatale dag (P) 2 door stereotaxic hersenchirurgie. De tdTomato verslaggever genexpressie werd ontdekt in P14 striatum, hetgeen wijst op dat een succesvolle Cre-loxP gemedieerde DNA recombinatie bij AAV-getransduceerde striatale cellen. We verder gevalideerd deze techniek door AAV-eGFP-Cre virussen in P2Foxp2fl/fl muizen microinjecting. Dubbele etikettering van GFP en Foxp2 bleek dat GFP-positieve cellen ontbrak Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggereert het verlies van Foxp2-eiwit in de AAV-eGFP-Cre getransduceerde striatale cellen. Samen genomen, tonen deze resultaten een effectieve genetische schrapping door stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in specifieke neuronale populaties in de neonatale hersenen van floxed transgene muizen. Kortom, biedt onze stereotaxic techniek een gemakkelijk en eenvoudig platform voor genetische manipulatie in neonatale muis hersenen. De techniek kan niet alleen worden gebruikt om te verwijderen van de genen in bepaalde gebieden van neonatale hersenen, maar het kan ook worden gebruikt om te injecteren farmacologische drugs, neuronale verklikstoffen, genetisch gemodificeerde optogenetics en chemogenetics eiwitten, neuronale activiteit indicatoren en andere reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen.
Introduction
Moderne studies van de structuur en functie van de hersenen vereisen meestal genetische manipulatie van specifieke genen in neuronale cellen. Om de sonde van de functies van verschillende genen, transgene muizen mutant allelen, met inbegrip van uitvoering zijn knock-out en knock-in allelen routinematig gegenereerd. Stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren is een standaardmethode om lokaal drugs, virussen, verklikstoffen en andere reagentia voor specifieke regio’s voor knaagdieren hersenen1,2. De stereotaxic hersenoperatie toe te passen op transgene muizen toelaat een om genetisch te manipuleren de genfunctie en de neuronale activiteit in specifieke neuronale populaties van de hersenen van de muis. De manipulatie van de type-specifieke cel biedt een krachtige aanpak om te ontcijferen van neuronale functies in complexe neurale circuits van de hersenen3,4,5.
Neurale ontwikkeling van het zenuwstelsel begint bij vroege embryonale stadia en de ontwikkelings processen blijven na de geboorte tot de jonge periode. Postnatale rijping van het zenuwstelsel omvat de precieze synaptic bedrading van neurale circuits, die is van essentieel belang voor fysiologische en cognitieve functies van de hersenen-6. Daarom studeren developmental gebeurtenissen die in neonatale tijd windows plaatsvinden is niet alleen belangrijk voor het begrijpen van normale neurale ontwikkeling, maar het kan ook inzicht verwerven in de pathogenese van neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen7 ,8. Hoewel de methoden van stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren direct beschikbaar2,9 zijn, zijn paar protocollen beschikbaar op het internet voor stereotaxic hersenoperatie in neonatale muizen10,11. In feite, zijn stereotaxic microinjections van reagentia in de hersenen van neonatale muis pups moeilijk, omdat het hoofd van neonatale pup is te kwetsbaar vast te stellen in de standaard stereotaxic apparaat. Niettemin, de toepassing van stereotaxic hersenoperatie op transgene muizen is haalbaar voor neonatale muizen12. Hier beschrijven we een eenvoudige methode met een zelfgemaakte setup uit te voeren stereotaxic hersenoperatie in pasgeboren muis pups. We laten zien dat deze techniek maakt het mogelijk om voorwaardelijk verwijderen floxed genen door AAV-uiten Cre DNA recombinase microinjecting in het striatum van reporter gene muizen en voorwaardelijk floxed transgene muizen. Deze techniek is ook van toepassing op het leveren van reagentia in de neonatale striatum van wild-type muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de huidige studie, we laten zien een eenvoudige en betrouwbare stereotaxic methode voor het injecteren van AAV virussen in het striatum van neonatale muis hersenen. Wij microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in het striatum van Ai14 verslaggever muizen op P2 en vervolgens de verslaggever genexpressie bij P14 geanalyseerd. We vonden getransduceerde AAV GFP-positieve cellen in de hele het striatum op rostrocaudal niveau. Bovendien, bijna alle GFP-positieve cellen uitgedrukt samen het tdTomato verslaggever gen in striatale …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie verleent MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, de nationale instituten van gezondheid onderzoek subsidie NHRI-EX106-10429NI, en de aanbevolen gebieden Research Center Program grant van het ministerie van onderwijs door Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, en de postdoctorale Fellowship verleent MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 en MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
