Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale
Summary
Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.
Abstract
Molti geni sono espressi nel cervello embrionale, e alcuni di loro sono continuamente espresso nel cervello dopo la nascita. Per tali geni espressi in modo persistente, possono funzionare per regolare il processo di sviluppo e/o funzione fisiologica nel cervello neonatale. Per indagare le funzioni neurobiologiche di specifici geni nel cervello, è essenziale che inattivano geni nel cervello. Qui, descriviamo un semplice metodo stereotassica per inattivare l’espressione genica nel corpo striato di topi transgenici alle finestre temporali neonatale. AAV-eGFP-Cre virus erano microiniettati nello striato di topi Ai14 reporter gene al giorno postnatale (P) 2 di chirurgia stereotassica cerebrale. L’espressione di gene reporter tdTomato è stata rilevata nello striatum P14, suggerendo che un successo Cre-loxP mediato ricombinazione del DNA in cellule trasdotte AAV striatali. Abbiamo validato ulteriormente questa tecnica da microinjecting virus AAV-eGFP-Cre nei topi P2Foxp2fl/fl . Doppia etichettatura di GFP e Foxp2 ha mostrato che le cellule GFP-positive mancavano immunoreactivity Foxp2 nello striatum P9, suggerendo la perdita della proteina Foxp2 in cellule striatali AAV-eGFP-Cre trasformata. Presi insieme, questi risultati dimostrano un’efficace eliminazione genetica da stereotassicamente iniettati virus AAV-eGFP-Cre in specifiche popolazioni neuronali nel cervello neonatale di topi transgenici floxed. In conclusione, la nostra tecnica stereotassica fornisce una piattaforma facile e semplice per manipolazione genetica in cervelli di topo neonatale. La tecnica non può essere utilizzata solo per eliminare geni in regioni specifiche del cervello neonatale, ma può essere utilizzato anche per iniettare droghe farmacologiche, traccianti neuronali, geneticamente optogenetica e proteine chemogenetics, indicatori di attività neuronale e altri reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse.
Introduction
Moderni studi sulla struttura e funzione del cervello di solito richiedono manipolazione genetica di specifici geni nelle cellule neuronali. Per sondare le funzioni dei geni differenti, topi transgenici portatori di alleli mutanti, tra cui knockout e knock-in alleli sono stati generati regolarmente. Chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti è un metodo standard per fornire localmente farmaci, virus, traccianti e altri reagenti a specifiche regioni del cervello del roditore1,2. Applicando la chirurgia stereotassica cervello di topi transgenici permette di manipolare geneticamente la funzione del gene e l’attività neuronale in specifiche popolazioni neuronali del cervello del mouse. La manipolazione di specifici del tipo di cella fornisce un approccio potente per decifrare funzioni neuronali nei complessi circuiti neurali del cervello3,4,5.
Sviluppo neurale del sistema nervoso comincia alle prime fasi embrionali, e continuano i processi di sviluppo dopo la nascita fino al periodo giovanile. Postnatale maturazione del sistema nervoso include il cablaggio sinaptico preciso dei circuiti neurali, che è essenziale per le funzioni fisiologiche e cognitive del cervello6. Pertanto, è importante non solo per comprendere lo sviluppo neurale normale studiare eventi inerenti allo sviluppo che si verificano in finestre temporali neonatale, ma può anche fornire comprensioni nella patogenesi di neurodevelopmental ed i disordini neuropsichiatrici7 ,8. Sebbene i metodi di chirurgia stereotassica cerebrale per roditori adulti sono prontamente disponibili2,9, alcuni protocolli sono disponibili su internet per chirurgia stereotassica cerebrale in topi neonatali10,11. Infatti, microiniezioni stereotassiche dei reagenti nei cervelli dei cuccioli del mouse neonatale sono difficili, perché la testa di pup neonatale è troppo fragile per essere fissato nell’apparato stereotassica standard. Tuttavia, l’applicazione della chirurgia stereotassica cerebrale di topi transgenici è fattibile per topi neonatali12. Qui, descriviamo un metodo semplice con un setup fatti in casa per eseguire chirurgia stereotassica cerebrale nei cuccioli di neonato mouse. Dimostriamo che questa tecnica permette di eliminare condizionalmente floxed geni di microinjecting ricombinasi AAV-esprimendo Cre DNA nello striato di topi gene reporter e condizionalmente floxed topi transgenici. Questa tecnica è anche applicabile per fornire reagenti nello striato neonatale di topi wild-type.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nello studio presente, dimostriamo un metodo semplice e affidabile stereotassica per iniettare il virus AAV nello striato del cervello di topo neonatale. Abbiamo microiniettati virus AAV-eGFP-Cre nello striato di topi reporter Ai14 a P2 e poi analizzata l’espressione del gene reporter presso P14. Abbiamo trovato che AAV trasdotte cellule GFP-positive in tutto il corpo striato a rostrocaudal livelli. Inoltre, quasi tutte le cellule GFP-positive co-espressi il gene reporter di tdTomato in cellule striatali, suggerendo una …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta dal Ministero della scienza e tecnologia garantisce a MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, gli istituti di ricerca nazionali di salute concede vi-EX106-10429NI e il programma di centro di ricerca aree consigliati sovvenzione da il Ministero dell’istruzione attraverso Brain Research Center, National Yang-Ming University di Taiwan, e Postdoctoral Fellowship concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
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