Stereotaxic kirurgi for genetisk manipulasjon i Striatal celler Neonatal musen hjerner
Summary
Vi beskriver en protokoll stereotaxic kirurgi med en hjemmelaget leder-fast enhet for microinjecting reagenser i striatum neonatal musen hjerner. Denne teknikken tillater genetisk manipulasjon i neuronal cellene i bestemte regioner neonatal musen hjerner.
Abstract
Mange gener som er uttrykt i embryonale hjernen, og noen av dem er kontinuerlig uttrykt i hjernen etter fødselen. For slike vedvarende uttrykt gener, kan de fungere for å regulere utviklingsprosess og/eller fysiologiske funksjon i neonatal hjernen. Undersøke nevrobiologiske funksjoner av bestemte gener i hjernen, er det viktig å deaktivere gener i hjernen. Her beskriver vi en enkel stereotaxic metode for å deaktivere byggkorn under striatum av transgene mus på neonatal tidsvinduer. AAV-eGFP-grobunn virus var microinjected i striatum Ai14 reporter genet mus på postnatal dag (P) 2 av stereotaxic hjernekirurgi. TdTomato reporter genuttrykk ble oppdaget i P14 striatum, antyder en vellykket grobunn-loxP mediert DNA rekombinasjon i AAV-transduced striatal celler. Vi ytterligere bekreftet denne teknikken av microinjecting AAV-eGFP-grobunn virus i P2Foxp2fl/fl mus. Dobbel merking av GFP og Foxp2 viste at GFP-positive celler manglet Foxp2 immunoreactivity i P9 striatum, tyder tap av Foxp2 protein i AAV-eGFP-grobunn transduced striatal celler. Til sammen viser disse resultatene en effektiv genetisk sletting av stereotaxically microinjected AAV-eGFP-grobunn virus bestemt neuronal bestander i neonatal hjernen floxed transgene mus. Avslutningsvis gir våre stereotaxic teknikken en lett og enkel plattform for genetisk manipulasjon i neonatal musen hjernen. Teknikken kan ikke bare brukes til å slette gener i bestemte regioner neonatal hjerner, men det også kan brukes til å injisere farmakologiske narkotika, neuronal tracers, genmodifiserte optogenetics og chemogenetics proteiner, neuronal aktiviteten indikatorer og andre reagenser i striatum neonatal musen hjerner.
Introduction
Moderne studier av strukturen og funksjon av hjernen krever vanligvis genetisk manipulasjon av bestemte gener i neuronal celler. For å undersøke funksjonene i ulike gener, transgene mus bærer mutant alleler, inkludert er knockout og banke i alleler rutinemessig generert. Stereotaxic hjernekirurgi for voksen gnagere er en standardmetode lokalt levere narkotika, virus, tracers og andre til bestemte områder av gnager hjerner1,2. Bruke stereotaxic hjernekirurgi transgene mus tillater en å manipulere genetisk gen funksjon og neuronal aktivitet bestemt neuronal bestander av musen hjernen. Celle type-spesifikk manipulering gir en kraftig tilnærming dechiffrere neuronal funksjoner i kompliserte nevrale kretser av hjernen3,4,5.
Neural utvikling av nervesystemet begynner på tidlig embryonale stadier, og utviklingsprosesser fortsette etter fødselen til juvenile perioden. Postnatal modning av nervesystemet inneholder nøyaktig synaptic ledninger av nevrale kretser, som er avgjørende for fysiologiske og kognitive funksjoner av hjernen6. Derfor studerer utviklingsmessige hendelser som oppstår i neonatal tidsvinduer er viktig ikke bare for å forstå normal neural utvikling, men det kan også gi innsikt i patogenesen av neurodevelopmental og nevropsykiatriske lidelser7 ,8. Selv om metoder for stereotaxic hjernekirurgi for voksen gnagere er lett tilgjengelig2,9, er noen protokoller tilgjengelige på Internett for stereotaxic hjernekirurgi i neonatal mus10,11. Faktisk er stereotaxic microinjections reagenser i hjernen av neonatal musen pups vanskelig, fordi hodet av neonatal pup er for skjøre til å være fast i standard stereotaxic apparatet. Likevel er anvendelse av stereotaxic hjernekirurgi til transgene mus mulig for neonatal mus12. Her beskriver vi en enkel metode med en hjemmelaget oppsett til å utføre stereotaxic hjernekirurgi i nyfødte musen pups. Viser vi at denne teknikken kan en betinget slette floxed gener ved microinjecting AAV-uttrykke grobunn DNA recombinase i striatum reporter genet mus og betinget floxed transgene mus. Denne teknikken er også aktuelt å levere reagenser i den nyfødte striatum av vill-type mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien viser vi en enkel og pålitelig stereotaxic metode for å injisere AAV virus i striatum neonatal musen hjerner. Vi microinjected AAV-eGFP-grobunn virus i striatum Ai14 reporter mus på P2 og deretter analysert genuttrykk reporter på P14. Vi fant AAV transduced GFP-positive celler i hele striatum på rostrocaudal nivå. Videre nesten alle GFP-positive celler co-uttrykkes tdTomato reporter genet i striatal celler, antyder en vellykket grobunn-loxP DNA rekombinasjon indusert av AAV-mediert uttrykk for grobunn aktiv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi gir MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, det nasjonale helse-forskningsinstitutter gir NHRI-EX106-10429NI og i utvalgte områder Center forskningsprogram stipend fra Departementet for utdanning gjennom hjernen Research Center, National Yang-Ming University i Taiwan, og postdoktorstipend gir MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 og MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
