Stereotaxic operation för genmanipulation i striatum celler i Neonatal mus hjärnor
Summary
Vi beskriver ett protokoll för stereotaxic kirurgi med en hemmagjord huvud-fast anordning för microinjecting reagens i striatum av neonatal mus hjärnor. Denna teknik tillåter genmanipulation i neuronala celler i vissa regioner av neonatal mus hjärnor.
Abstract
Många gener uttrycks i embryonala hjärnor, och några av dem uttrycks kontinuerligt i hjärnan efter födseln. För sådana ständigt uttryckt gener, kan de fungera för att reglera den utvecklingsprocess och/eller fysiologisk funktion i neonatal hjärnor. För att undersöka neurobiologiska funktionerna av specifika gener i hjärnan, är det nödvändigt att inaktivera gener i hjärnan. Här, beskriver vi en enkel stereotaxic metod för att inaktivera genuttryck i striatum hos transgena möss på neonatal tidsfönster. AAV-andra-Cre virus var microinjected i striatum Ai14 reporter gen möss vid postnatal dag (P) 2 av stereotaxic hjärnkirurgi. TdTomato reporter genuttrycket upptäcktes i P14 striatum, vilket tyder på en lyckad Cre-loxP medierad DNA-rekombination i AAV-sensorik striatum celler. Vi valideras ytterligare denna teknik av microinjecting AAV-andra-Cre virus i P2Foxp2fl/fl möss. Dubbel märkning av god Jordbrukarsed och Foxp2 visade att GFP-positiva celler saknade Foxp2 immunoreaktivitet i P9 striatum, vilket tyder på förlusten av Foxp2 protein i AAV-andra-Cre sensorik striatum celler. Sammantaget visar dessa resultaten en effektiv genetiska radering av stereotaxically microinjected AAV-andra-Cre virus i neuronala specifika populationer i neonatal hjärnor av floxed transgena möss. Sammanfattningsvis, ger vår stereotaxic teknik en lätt och enkel plattform för genmanipulation i neonatal mus hjärnor. Tekniken kan inte endast användas till att ta bort gener i specifika regioner i neonatal hjärnor, men det kan också användas för att injicera farmakologiska läkemedel, neuronala spårämnen, genetiskt modifierade optogenetik och chemogenetics proteiner, neuronal aktivitet indikatorer och övriga reagenserna i striatum av neonatal mus hjärnor.
Introduction
Moderna studier av struktur och funktion av hjärnan kräver vanligtvis genmanipulation av specifika gener i neuronala celler. För att undersöka funktionerna av olika gener, transgena möss bär muterade alleler, inklusive har knockout och inpressning alleler rutinmässigt genererats. Stereotaxic hjärnkirurgi för vuxna gnagare är en standardmetod att leverera lokalt droger, virus, spårämnen och andra reagenser till specifika regioner i gnagare hjärnor1,2. Tillämpa den stereotaxic hjärnkirurgi på transgena möss tillåter en att genetiskt manipulera geners funktion och neuronal aktivitet i specifika neuronala populationer av mus hjärnan. Cell typspecifika manipulation ger en kraftfull metod för att dechiffrera neuronala funktioner i komplexa neurala kretsar av hjärnan3,4,5.
Neural utveckling av nervsystemet börjar vid tidiga embryonala stadier och utvecklingsprocesser fortsätta efter födseln tills juvenil period. Postnatal mognad av nervsystemet innehåller den exakta synaptic ledningar av neurala kretsar, vilket är viktigt för fysiologiska och kognitiva funktioner i hjärnan6. Därför studerar utvecklande händelser som inträffar i neonatal tidsfönster är viktigt inte bara för att förstå normala neural utveckling, men det kan också ge insikter i patogenesen av neurologiska och neuropsykiatriska störningar7 ,8. Även om metoderna för stereotaxic hjärnkirurgi för vuxna gnagare är lättillgängliga2,9, finns några protokoll på internet för stereotaxic hjärnkirurgi neonatala möss10,11. I själva verket är stereotaxic microinjections av reagenser i hjärnan hos nyfödda musungar svårt, eftersom chefen för neonatal pup är alltför bräcklig skall fastställas i den standard stereotaxic apparaten. Tillämpningen av stereotaxic hjärnkirurgi på transgena möss är dock möjligt för neonatala möss12. Här, beskriver vi en enkel metod med en hemmagjord inställning att utföra stereotaxic hjärnkirurgi i nyfödda musungar. Vi visar att denna teknik gör att man kan radera villkorligt floxed gener genom microinjecting AAV-uttryckande Cre DNA recombinase i striatum reporter gen möss och villkorligt floxed transgena möss. Denna teknik gäller även att leverera reagenser i neonatal striatum av vildtyp möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den aktuella studien visar vi en enkel och tillförlitlig stereotaxic metod för att injicera AAV virus i striatum av neonatal mus hjärnor. Vi microinjected AAV-andra-Cre virus i striatum Ai14 reporter möss på P2 och sedan analyseras reporter genuttryck vid P14. Vi hittade AAV sensorik GFP-positiva celler i hela striatum på rostrocaudal nivåer. Dessutom uttryckte nästan alla GFP-positiva celler tillsammans den tdTomato reporter gen i striatum celler, vilket tyder på en lyckad Cre-loxP DNA-rekombination inducerad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik ger MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, hälsa nationella forskningsinstituten bevilja NHRI-EX106-10429NI och utvalda områden Center forskningsprogrammet bidrag från Undervisningsministeriet genom hjärnan Research Center, National Yang-Ming University i Taiwan, och postdoktorsstipendium bidrag MOST106-2811-B-010-031 (S.-YC), MOST105-2811-B-010-036 och MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
