Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi
Summary
Biz yenidoğan fare beyni striatum microinjecting reaktifler için ev yapımı bir baş-sabit aygıt ile bir protokol stereotaksik cerrahi açıklamak. Bu teknik, yenidoğan fare beyni, özel bölgelerin nöronal hücrelerin genetik manipülasyon sağlar.
Abstract
Birçok genler embriyonik beyinlerinde ifade edilir ve bazıları sürekli doğumdan sonra beyinde ifade edilir. Israrla ifade böyle genler için gelişimsel süreci ve/veya neonatal beynindeki fizyolojik fonksiyon düzenlemek için çalışmayabilir. Beyindeki belirli genlerin nörobiyolojik işlevleri araştırmak için beyindeki genleri devre dışı bırakabilirsiniz esastır. Burada, striatum gen ifadesinde transgenik fareler yenidoğan zaman Windows devre dışı bırakabilirsiniz için basit bir stereotaksik yöntem açıklanmaktadır. AAV-eGFP-Cre virüs Ai14 muhabir gen fareler striatum Doğum sonrası gün (P) 2 stereotaksik beyin ameliyatı tarafından microinjected. TdTomato muhabir gen ekspresyonu P14 striatum, başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon AAV transduced striatal hücrelerdeki aracılı düşündüren tespit edildi. Daha fazla bu teknik AAV-eGFP-Cre virüs P2Foxp2fl/fl fareler microinjecting tarafından doğrulanmış. Çift etiketleme GFP ve Foxp2 GFP pozitif hücreler P9 striatum, AAV-eGFP-Cre transduced striatal hücrelerdeki Foxp2 protein kaybı düşündüren Foxp2 immunoreactivity yoksun gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yenidoğan beynindeki belirli nöron popülasyonları floxed transgenik fareler Stereotaxic microinjected AAV-eGFP-Cre virüsler tarafından etkili bir genetik silme işlemini göstermektedir. Sonuç olarak, bizim stereotaksik tekniği yenidoğan fare beynindeki genetik manipülasyon için kolay ve basit bir platform sağlar. Bu teknik sadece genler, yenidoğan beyinlerinin belirli bölgelerde silmek için kullanılamaz, ancak farmakolojik ilaçlar, nöronal izleyiciler, genetiği değiştirilmiş optogenetics ve chemogenetics proteinler, nöronal aktivite göstergelerini enjekte etmek için de kullanılabilir ve diğer reaktifler striatum, yenidoğan fare beyinlerinin içine.
Introduction
Modern çalışmalar yapısı ve beyin fonksiyonu genellikle belirli genler nöronal hücrelerdeki genetik manipülasyon gerektirir. Farklı genler, transgenik fareler de dahil olmak üzere mutant gen taşıyan fonksiyonlar soruşturma için nakavt ve çakma allelleri düzenli olarak yeniden üretilmedi. Stereotaksik beyin ameliyatı yetişkin kemirgen için yerel olarak uyuşturucu, virüsler, izleyiciler ve diğer kimyasalları kemirgen beyin1,2özel bölgeler için teslim etmek için standart bir yöntemdir. Stereotaksik beyin ameliyatı transgenik fareler için uygulama bir genetik olarak gen fonksiyon ve fare beynin belirli nöron popülasyonları nöronal aktivite işlemek için izin verir. Hücre türüne özgü işleme karmaşık sinir devreleri beyin3,4,5nöronal işlevlerinde deşifre etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Sinir sisteminin sinirsel gelişme aşamalarında erken embriyonik başlar ve gelişim süreçleri Juvenil dönemine kadar doğumdan sonra devam edin. Postnatal olgunlaşma sinir sistemi beyin6fizyolojik ve bilişsel işlevler için temel sinir devreleri, hassas sinaptik kablolama içerir. Bu nedenle, yenidoğan zaman pencerelerde oluşan gelişimsel olaylarını eğitim sadece normal sinirsel gelişim anlamak için önemlidir, ancak de nörogelişimsel ve Nöropsikiyatrik bozukluklar7 patogenezinde anlayışlar sağlayabilir ,8. Stereotaksik beyin ameliyatı yöntemleri yetişkin kemirgen için hazır2,9, olmasına rağmen birkaç protokolleri stereotaksik beyin ameliyatı yenidoğan fareler10,11‘ deki yönergeleri için Internet üzerinde kullanılabilir. Yenidoğan yavru Başkanı standart stereotaksik aparatı düzeltilmesi için çok kırılgan olduğu için aslında, reaktifler stereotaksik microinjections yenidoğan fare pups beyinlerinin içine, zordur. Yine de, stereotaksik beyin ameliyatı uygulamaya transgenik farelerde neonatal fareler12için mümkün olabilir. Burada, yeni doğmuş fare pups içinde stereotaksik beyin ameliyatı gerçekleştirmek için ev yapımı bir kurulum ile basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik bir muhabir gen fareler ve koşullu olarak floxed transgenik fareler striatum AAV ifade Cre DNA recombinase microinjecting tarafından floxed genler koşullu olarak silmek izin verdiğini göstermektedir. Bu teknik aynı zamanda reaktifler vahşi tipi farelerin striatum yenidoğan sunmak için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu da çalışmanın, yenidoğan fare beyni striatum AAV virüs enjekte için basit ve güvenilir stereotaksik yöntem gösterilmektedir. Biz P2, Ai14 muhabir farelerin striatum içine AAV-eGFP-Cre virüs microinjected ve muhabir gen ekspresyonu P14, analiz ettik. AAV GFP pozitif hücreler boyunca striatum, rostrocaudal düzeyde transduced bulduk. Ayrıca, neredeyse tüm GFP pozitif hücreler AAV aracılı ifade Cre faaliyet tarafından indüklenen başarılı bir Cre-loxP DNA rekombinasyon düşündüren tdTomato muhabi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Bilim Bakanlığı tarafından desteklenen ve teknoloji MOST104-2311-B-010-010-MY3, verir MOST106-2321-B-010-012, Ulusal Sağlık araştırma enstitüleri NHRI-EX106-10429NI ve seçme alanlarda araştırma merkezi programı hibe verin Eğitim Bakanlığı aracılığıyla beyin Araştırma Merkezi, Ulusal Yang Ming Üniversitesi Tayvan, ve doktora sonrası bursu MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 ve MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.) verir.
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
