Ett protokoll för snabb CRISPR/Cas9-medierad gen störningar i mus och människans primära hematopoetiska celler är beskrivs i denna artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins introduceras via elektroporation med sgRNAs genereras genom in vitro- transkription och kommersiella Cas9. Hög redigering effektivitetsvinster uppnås med begränsad tid och finansiella kostnaden.
Framsteg i fältet hematopoetiska stamceller (Förenta) har varit hjälpt av metoder att genetiskt ingenjör primära stamceller samt djurmodeller. Komplett gen ablation i Förenta krävs för generering av knockoutmöss som Förenta kunde isoleras, och gen ablation i primära mänskliga Förenta inte var möjligt. Viral transduktion kunde användas för knock-down metoder, men dessa led från variabel effekt. I allmänt, genetisk manipulering av mänskliga och mus hematopoetiska celler hindrades av låg effektivitet och omfattande tid och kostnad åtaganden. Nyligen, CRISPR/Cas9 expanderat dramatiskt förmågan att ingenjör DNA i däggdjursceller. Dock har tillämpningen av CRISPR/Cas9 för hematopoetiska celler varit utmanande, främst på grund av deras låga transfection effektivitetsvinster, toxiciteten av plasmid-baserade metoder och långsam handläggningstid av virus-baserat protokoll.
En snabb metod att utföra CRISPR/Cas9-medierad gen redigering i murina och mänskliga hematopoetiska stamceller och stamceller celler med knockout effektivitetsvinsterna av upp till 90% finns i denna artikel. Denna strategi använder tredjeparts en ribonukleoprotein (RNP) leverans strategi med ett strömlinjeformat arbetsflöde för tre dagar. Användning av Cas9-sgRNA RNP möjliggör en hit-and-run förhållningssätt, att införa något EXOGEN DNA-sekvenser i genomet hos redigerade celler och minska off-target effekter. RNP-baserade metoden är snabb och enkel: det inte kräver kloning av sgRNAs, virus beredning eller specifika sgRNA kemisk modifiering. Med detta protokoll bör forskare kunna generera framgångsrikt knockouts av en gen av intresse i primära hematopoetiska celler inom en vecka, inklusive stilleståndstider för oligonukleotiden syntes. Detta tillvägagångssätt gör att en mycket bredare grupp av användare att anpassa detta protokoll för deras behov.
Tillkomsten av CRISPR/Cas9 har radikalt förenklad gen redigering i däggdjursceller. Tidiga CRISPR/Cas9 protokoll utnyttjas plasmid eller virus-baserat leverans av Cas9 protein och sgRNA1,2,3. Dessa synsätt visat revolutionerande för utveckling av cellulära och djurs modeller och har också framgångsrikt tillämpat primära hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs)4,5. Dessa metoder har dock ett antal nackdelar. Det första förblir gen avbrott effektivitet ofta under 50%4,5. Medan detta är tillräckligt för att generera knockout (KO) kloner i cellinjer, gör nödvändigheten för kortfristiga kultur HSPCs inte kan bli föremål för en sådan strategi. Det andra begränsar kravet för kloning mängden sgRNAs som kan provas i enda experiment och genererar stora, svårt att transfect konstruktioner. Tredje, dessa metoder tvinga forskare att sakta handläggningstider.
För att övervinna dessa begränsningar, vår grupp utvecklade och publicerade nyligen ett alternativt CRISPR/Cas9 tillvägagångssätt i HSPCs använder Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs)-baserade leverans6. I denna strategi, rå komponenter av CRISPR (Cas9 protein och in vitro- transkriberat sgRNA) är pre-komplex och direkt levererade till målcellerna via elektroporation (figur 1). Halveringstiden för Cas9-sgRNA RNP komplexet är kortare än tid det plasmid eller viral nukleinsyra är transkriberas, off-target priset är lägre än tidiga metoder7. Dessutom lägger metoden RNP till förmån för att eliminera någon källa av exogent DNA, som slumpmässigt kan integrera i målet cellen genomet leder till cellulära omvandling.
Detta protokoll baseras på ett smidigt arbetsflöde för RNP-baserade gen störningar experiment, som representerade i figur 1. Det första steget utforma och beställa primers för varje sgRNA. Dessa primers används för att göra sgRNA DNA mallar som används för in vitro- transkription (IVT) för att få sgRNAs. Renade sgRNAs inkuberas därefter med tidigare köpta Cas9 protein, till form Cas9-sgRNA RNP komplex. Slutligen är pre-komplex Cas9-sgRNA RNPs electroporated in i celler. Efter elektroporation, redigering effektivitet kan testas och in vitro-/i vivo experiment kan startas, beroende på behov. Nedan en detaljerad beskrivning av detta innovativa experimentella tillvägagångssätt kan hittas.
Den RNP-strategi som beskrivs i detta detaljerade protokoll möjliggör effektiv gen knockout i både mus och mänskliga primära hematopoetiska celler samt som i suspension cellinjer. Även om mycket hög KO effektivitetsvinster erhålls ofta, måste flera kritiska variabler beaktas. Först, ordentlig exon val är nyckeln till att garantera att effektiv ditsatta inkorporering motsvarar gen knockout. Två viktiga faktorer relaterade till exon val är bevarande över isoformer och exon position inom avskrifter. Isoform uttrycksmönster är variabel över celltyper, så om genen KO över celltyper önskas, exoner som är oföränderliga mellan cell typer bör riktas. Isoform mönster kan verifieras via q-PCR eller RNA-sekvensering data. Exon position inom avskrifter, det är bäst att rikta tidiga exoner som frameshift mutationer i terminalen eller näst sista exon kan undgå nonsens-medierad sönderfall10, producerar proteiner med romanen eller okända funktioner i stället för sann nullvärden.
Bestämma ditsatta är frekvens ett kritiskt steg att uppskatta KO effektivitet och korrekt tolka biologiska resultatet av experimentet. Endonucleases analyser (t.ex. surveyor assay) har fördelen att vara relativt snabbt och enkelt att utföra. Dock tenderar de att vara felaktig på grund av betydande bakgrund signaler och resultaten är ofta svårt att reproducera. Dessutom ger de inte information om kvaliteten på indels som genereras (t.ex. längd infogningar och borttagningar) i experimentet. Sanger sekvensering ger ett värdefullt alternativ till Amiiiiin analyser. Plattformar såsom TIDE11 (https://tide.nki.nl/) hjälper till att sönderdela sanger spår och producera exakta uppskattningar av alleliska avbrott effektivitet, samtidigt som frekvensen av enskilda indels. Den stora nackdelen är ett absolut beroende av hög kvalitet Sanger sekvensering spår. Hög genomströmning amplikon sekvensering övervinner de flesta av dessa frågor. Amplikon bibliotek kan framställas med mycket låg DNA ingångar och hög täckning garanterar tillförlitliga resultat. För att minska kostnaden för amplikon sekvensering, spike vi vanligtvis i amplikon bibliotek i större sekvensering löprundor (e.g. RNA-sekvensering) med endast 1-1,5% av den totala läser. Slutligen, för att bekräfta lyckad knockout, vi starkt rekommenderar att bedöma proteinnivåer av western blotting eller flödescytometri, när det är möjligt.
Som tidigare beskrivits, den metod som presenteras här är snabb och okomplicerad och representerar ett nytt verktyg att studera genen knock out-mus och mänskliga HSPCs. Medan våra protokoll innehåller instruktioner för genen knockout med en tip-baserad elektroporation system, har andra system visat sig vara mycket effektiv12,13.
Två stora begränsningar måste erkännas när det gäller metoden RNP. Först, som beskrivs av vår grupp, HSPCs electroporated med in vitro-livskraft transkriberat sgRNAs avsevärt kan äventyras av elektroporation, särskilt när förhållandena inte är optimala6. Om det behövs, kan kommersiellt syntetiskt sgRNAs (dvs. eliminera in vitro- transkription) lösa detta problem. Dessa blir billigare med tiden och kan köpas från flera leverantörer. I det här fallet in vitro- transkription kunde användas för att generera en pool av sgRNA till skärmen för effekt, och sedan den mest effektiva sgRNA(s) kan väljas för syntes. Den andra stora begränsningen av RNP strategi är oförmågan att spåra framgångsrikt transfekterade celler, som i viral-baserade metoder. Dock kan hög KO effektivitet och snabb redigering uppnås med Cas9-sgRNA RNPs uppväga dessa nackdelar i många experimentella scenarier. Vi rekommenderar att du använder hög genomströmning amplikon sekvensering att exakt bestämma avbrott effektivitet i varje experiment. Om den knock-out av genen av intresse förväntas ge en proliferativ fenotyp (dvs. antingen minskat eller ökat spridning jämfört med vildtyp celler), att bestämma frekvensen ditsatta vid flera tidpunkter gör att man kan bedöma huruvida KO celler genomgå anrikning (dvs ditsatta frekvens ökar över tid) eller är outcompeted (dvs. ditsatta frekvens minskar med tiden).
Utför in vivo eller in vitro- experiment för att förstå de biologiska effekterna av förlust av geners funktion kräver lämpliga kontroller. Som tidigare nämnts, in vitro- transkriberat sgRNAs kan vara giftigt för celler, särskilt primära progenitor cells6. DNA dubbel-strand raster orsakas av Cas9 protein kan dessutom orsaka gen oberoende anti-proliferativ svar14. Därför vi använder ofta ett antal kontroll sgRNAs CRISPR experiment och rekommendera en cell surface markör uttryckt på din celltyp samt en andra målgenen som inte uttrycks.
Kortfristiga kultur av mänskliga HSPCs i närvaro av cytokiner ökar den gen avbrott effektivitet6 och är nödvändigt för att uppnå hög verkningsgrad KO. Vi har hittat 36-48 timmar för att vara den idealiska kultur före elektroporation6. Efter elektroporation, cellerna kan vara ytterligare odlade att hålla i åtanke att ju längre kulturen desto större är risken att förlora Multilinjärt engraftment kapacitet. Därför, vi utför vanligen transplantationer 6 timmar efter elektroporation och aldrig senare än 24 timmar efter elektroporation.
CRISPR/Cas9 förbättrats dramatiskt forskare förmåga att framgångsrikt redigera genomet hos däggdjursceller. Att göra gen störningar mer genomförbart i primära hematopoetiska progenitorceller förutspås att snabbt öka den vetenskapliga kunskapen inom området HSPCs och hematologiska sjukdomar. Ännu viktigare, gör det protokoll som beskrivs här det också möjligt att samtidigt generera flera knockouts med hög verkningsgrad, vilket möjliggör modellering av komplexa genetiska landskap, ses ofta i leukemic sjukdomar.
Även om de protokoll som beskrivs häri är fokuserade på genen störningar, kan de lätt anpassas för genen inpressning experiment. Detta kan åstadkommas genom samtidig leverans av enkelsträngat oligonukleotiden mallar för homologi-regisserad reparation6,13 (HDR) eller genom transduktion av celler post-elektroporation med AAV6 vektorer som innehåller den homologi mall12. Förmågan att reparera eller införa specifika mutationer i HSPCs kommer att underlätta nya terapeutiska strategier för genterapi och utökade studier av cancer driver mutationer i AML och andra hematologiska sjukdomar. HDR i mänskliga HSPCs har varit framgångsrika6,12,13, mus HSPCs har varit svårt att redigera använder denna strategi6. Optimering av HDR protokoll i mänskliga och särskilt i mus HSPCs kommer att möjliggöra mer specifik redigering och utvecklingen av verktyg för att spåra redigerade celler använder endogena taggning.
Slutligen är det också tänkt att störningar av muterade gain-of-function alleler kan utgöra en potentiell terapeutisk metod för medfödda och förvärvade hematopoetiska störningar. I det här fallet rekommenderas en DNA-gratis strategi för att undvika möjliga integrationer som kunde främja omvandling. Metoden ”hit and run” minskar dessutom risken för oönskad off-effekter. Mer ansträngning behövs för att utveckla specifika leveranssystem som skulle öppna nya vägar för behandling av maligna och icke-maligna hematologiska sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Cancer förebyggande och forskning Institutet Texas (RP160283, RP140001 och R1201), Gabrielles Angel Foundation för cancerforskning, Stiftelsen Edward P. Evans och NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, CA193235 och DK107413). M.C.G. stöds av Baylor forskning förespråkar för Student forskare. Flödescytometri stöddes delvis av NIH (National Center for forskningsresurser grant S10RR024574, nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar AI036211 och National Cancer Institute P30CA125123) för den Baylor College of Medicine Flödescytometri och Cell sortering Core.
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |