Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.
Progressi nel campo delle cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono stato favoriti da metodi di ingegnere geneticamente cellule progenitrici primario così come modelli animali. Gene completa ablazione in HSCs necessaria la generazione di topi knockout da cui HSCs potrebbe essere isolato e ablazione genica nelle HSC umane primarie non era possibile. Trasduzione virale potrebbe essere utilizzato per approcci knock-down, ma questi soffriva di efficacia variabile. In generale, genetica manipolazione dell’essere umano e cellule ematopoietiche del mouse è state ostacolate da minor efficienza e tempo esteso e impegni di costo. Recentemente, CRISPR/Cas9 ha ampliato notevolmente la capacità di progettare il DNA delle cellule di mammiferi. Tuttavia, l’applicazione di CRISPR/Cas9 a cellule ematopoietiche è stato impegnativo, principalmente a causa della loro efficienza di trasfezione basso, la tossicità di approcci basati su plasmide e il tempo di risposta lento di protocolli basati su virus.
In questo articolo viene fornito un metodo rapido per eseguire CRISPR/Cas9-mediata del gene editing in cellule progenitrici e staminali ematopoietiche murine ed umane celle con efficienze di knockout fino al 90%. Questo approccio utilizza una strategia di consegna della ribonucleoproteina (RNP) con un flusso di lavoro ottimizzato di tre giorni. L’uso di Cas9-sgRNA RNP consente un approccio mordi e fuggi, non introducendo nessun sequenze di DNA esogene nel genoma di celle modificate e riducendo gli effetti fuori bersaglio. Il metodo basato su RNP è veloce e semplice: non richiede la clonazione di sgRNAs, preparazione di virus o modificazione chimica sgRNA specifici. Con questo protocollo, gli scienziati dovrebbero essere in grado di generare correttamente Ko di un gene di interesse in cellule ematopoietiche primarie entro una settimana, compresi i tempi di fermo per la sintesi del oligonucleotide. Questo approccio permetterà un gruppo molto più ampio di utenti di adattare questo protocollo per le loro esigenze.
L’avvento di CRISPR/Cas9 ha radicalmente semplificato gene editing in cellule di mammifero. Primi CRISPR/Cas9 protocolli utilizzati plasmide o virus-ha basato la consegna di Cas9 proteina e sgRNA1,2,3. Questi approcci si è rivelata rivoluzionari per lo sviluppo di modelli cellulari e animali e sono stati applicati con successo anche al primario ematopoietiche staminali e progenitrici cellule (HSPCs)4,5. Tuttavia, questi metodi hanno una serie di svantaggi. In primo luogo, l’efficienza di rottura del gene rimane spesso di sotto 50%4,5. Mentre questo è sufficiente per la generazione di cloni di knockout (KO) in linee cellulari, la necessità per la coltura di breve durata rende HSPCs non destinabili a tale strategia. In secondo luogo, il requisito per la clonazione limita la quantità di sgRNAs che possono essere testati in singoli esperimenti e genera grandi, difficili a transfect costrutti. In terzo luogo, questi approcci forzare gli scienziati a rallentare i tempi di consegna.
Per superare queste limitazioni, il nostro gruppo ha sviluppato e pubblicato di recente un approccio alternativo di CRISPR/Cas9 in HSPCs utilizzando Cas9-sgRNA ribonucleoproteine (RNP)-base di consegna6. In questa strategia, i componenti grezzi di CRISPR (Cas9 proteina e in vitro trascritto sgRNA) pre-complessati che viene consegnato direttamente in cellule bersaglio tramite elettroporazione (Figura 1). Come l’emivita del complesso Cas9-sgRNA RNP è inferiore al tempo che plasmide o dell’acido nucleico virale è trascritto, il tasso di fuori bersaglio è inferiore rispetto ai primi approcci7. Inoltre, l’approccio di RNP aggiunge il vantaggio di eliminare qualsiasi fonte di DNA esogeno, che casualmente può integrare nel genoma della cellula bersaglio che conduce alla trasformazione cellulare.
Questo protocollo è basato su un flusso di lavoro ottimizzato per gli esperimenti di rottura del gene RNP-basato, come rappresentato nella Figura 1. Il primo passo è progettare e ordinare i primers per ogni sgRNA. Questi iniettori sono utilizzati per fare modelli di DNA sgRNA che vengono utilizzati per trascrizione in vitro (IVT) per ottenere il sgRNAs. SgRNAs purificata sono poi incubate con proteina Cas9 acquistata in precedenza, per formare Cas9-sgRNA RNP. Infine, pre-complessati Cas9-sgRNA RNP sono individulamente nelle cellule. A seguito di elettroporazione, editing efficiente può essere testato e in vitro/in vivo esperimenti possono essere avviati, a seconda delle esigenze. Qui di seguito una descrizione dettagliata di questo innovativo approccio sperimentale può essere trovata.
L’approccio di RNP descritto in questo protocollo dettagliato consente ad eliminazione diretta efficiente gene in cellule ematopoietiche primarie umane così come in linee cellulari di sospensione sia il mouse. Anche se spesso si ottengono rendimenti molto elevati di KO, diverse variabili critiche devono essere considerati. In primo luogo, scelta corretta dell’essone è chiave nel garantire che indel efficiente incorporazione corrisponde a knockout del gene. Due fattori importanti legate alla scelta di essone sono conservazione attraverso isoforme e nell’esone posizione all’interno di trascrizioni. Modelli di espressione di isoforme sono variabili attraverso tipi di cellule, così se è desiderato il gene KO attraverso tipi di cellule, esoni che sono invarianti tra cella tipi dovrebbero essere mirati. Modelli di isoforma possono essere verificate utilizzando q-PCR o dati di sequenziamento di RNA. Per posizione di essone all’interno di trascrizioni, è preferibile di esoni precoce di destinazione come mutazioni frameshift nel terminale o penultima essone potrebbe fuoriuscire deperimento assurdità-mediato10, producendo proteine con romanzo o funzioni sconosciute, piuttosto che di veri valori null.
Determinare la indel frequenza è un passo fondamentale per valutare l’efficienza di KO e interpretare correttamente il risultato biologico dell’esperimento. Saggi di endonucleasi (ad es. analisi di surveyor) hanno il vantaggio di essere relativamente veloce e facile da eseguire. Tuttavia, essi tendono ad essere imprecisa a causa di segnali di fondo significativa e risultati sono spesso difficili da riprodurre. Inoltre, non forniscono informazioni sulla qualità del indels generato (ad es. lunghezza di inserimenti ed eliminazioni) nell’esperimento. Sanger sequenziamento fornisce una valida alternativa al endonucleasi saggi. Piattaforme come marea11 (https://tide.nki.nl/) aiutano a scomporre le tracce sanger e produrre stime accurate di efficienza rottura allelica, fornendo anche le frequenze dei singoli indels. Il principale svantaggio è una dipendenza assoluta sulle tracce di sequenziamento Sanger alta qualità. Sequenziamento degli ampliconi di alto-rendimento supera la maggior parte di questi problemi. Amplicon librerie possono essere preparate a partire con gli ingressi di DNA molto bassi e l’alta copertura assicura risultati affidabili. Per ridurre il costo del sequenziamento degli ampliconi, abbiamo solitamente spike in librerie amplicone nei funzionamenti di sequenziamento più grandi (per esempio RNA-sequenziamento) utilizzando solo l’1-1,5% del totale si legge. Infine, per confermare il successo ad eliminazione diretta, si fortemente consiglia di valutare i livelli della proteina dalle macchie occidentali o flusso cytometry, quando possibile.
Come descritto in precedenza, il metodo presentato qui è veloce e semplice e rappresenta un nuovo strumento per studiare il gene knock out in mouse e HSPCs umano. Mentre il nostro protocollo fornisce istruzioni per knockout del gene con un sistema basato su suggerimento di elettroporazione, altri sistemi sono stati dimostrati per essere altamente efficace12,13.
Due limitazioni principali devono essere riconosciuti per quanto riguarda l’approccio di RNP. In primo luogo, come descritto dal nostro gruppo, la redditività delle HSPCs elettroporate con in vitro trascritto sgRNAs può essere significativamente compromessa dall’elettroporazione, soprattutto quando le condizioni non sono ottimali6. Se necessario, sgRNAs commercialmente sintetizzato (cioè eliminando in vitro trascrizione) può superare questo problema. Questi stanno diventando sempre meno costosi con il tempo e possono essere acquistati da diversi fornitori. In questo scenario, trascrizione in vitro poteva essere utilizzati per generare un pool di sgRNA alla schermata per efficacia, e quindi il sgRNA(s) più efficiente può essere selezionato per la sintesi. La seconda limitazione principale dell’approccio RNP è l’incapacità di tenere traccia di cellule trasfettate con successo, come in approcci basati su virale. Tuttavia, l’elevata efficienza di KO e modifica rapida ottenuta con Cas9-sgRNA RNP possono superare questi inconvenienti in molti scenari sperimentali. Si consiglia di utilizzare il sequenziamento degli ampliconi di alto-rendimento per determinare esattamente l’efficienza di rottura in ogni esperimento. Se il knock-out del gene di interesse è previsto a conferire un fenotipo proliferativo (ossia, diminuita o aumentata proliferazione rispetto alle cellule wild-type), determinare la frequenza di indel a più punti di tempo permette di valutare se KO cellule sottoporsi ad arricchimento (cioè indel frequenza aumenta nel tempo) o sono outcompeted (cioè. indel frequenza diminuisce nel corso del tempo).
Esperimenti in vivo o in vitro per comprendere gli effetti biologici della perdita di funzione del gene richiede i controlli appropriati. Come precedentemente accennato, in vitro trascritto sgRNAs può essere tossico per le cellule, cellule progenitrici soprattutto primaria6. Inoltre, rotture a doppio filamento del DNA causate dalla proteina Cas9 possono causare gene indipendente risposta antiproliferativa14. Di conseguenza, abbiamo spesso utilizzare un numero di controllo sgRNAs in CRISPR esperimenti e consiglia un indicatore della superficie delle cellule espresso sul tuo tipo di cellulare, nonché un secondo gene di destinazione che non è espresso.
Coltura di breve durata di umana HSPCs in presenza di citochine aumenta il gene interruzione efficienza6 e necessario raggiungere KO ad alta efficienza. Abbiamo trovato 36-48 ore per essere il periodo ideale di coltura prima dell’elettroporazione6. A seguito di elettroporazione, le cellule possono essere ulteriormente coltivate tenendo presente che più lunga è la cultura più alto il rischio di perdere la capacità di attecchimento multilineare. Di conseguenza, di solito eseguire trapianti 6 ore dopo l’elettroporazione e mai oltre 24 ore dopo l’elettroporazione.
CRISPR/Cas9 ha migliorato notevolmente la capacità degli scienziati di modificare correttamente il genoma delle cellule di mammiferi. Rendendo più fattibile rottura del gene in cellule progenitrici ematopoietiche primario è preveduta per migliorare rapidamente le conoscenze scientifiche nel campo della HSPCs e malattie ematologiche. D’importanza, il protocollo descritto qui rende anche possibile generare contemporaneamente più forature con alta efficienza, che consente la modellazione di paesaggi genetici complessi, spesso visto nelle malattie leucemiche.
Anche se i protocolli descritti nel presente documento sono focalizzati sulla rottura del gene, possono essere facilmente adattati per gli esperimenti del gene knock-in. Questo può essere realizzato attraverso la veicolazione di modelli di singolo-incagliato oligonucleotide per omologia-diretto riparazione6,13 (HDR) o attraverso la trasduzione di cellule post-elettroporazione con AAV6 vettori contenenti il omologia modello12. La capacità di riparare o introdurre specifiche mutazioni in HSPCs faciliterà nuove strategie terapeutiche per la terapia genica e lo studio espanso di mutazioni di driver del cancro in AML e altre malattie ematologiche. Mentre HDR in HSPCs umano è stato successo6,12,13, mouse HSPCs sono stati difficili da modificare utilizzando questa strategia6. Ottimizzazione dei protocolli HDR in umani e in particolare del mouse HSPCs consentirà di editing più specifici e lo sviluppo di strumenti per tenere traccia celle modificate utilizzando la codifica endogeno.
Infine, è anche previsto che la rottura di alleli mutanti di guadagno di funzione potrebbe rappresentare un potenziale approccio terapeutico per disordini ematopoietici congeniti ed acquisiti. In questo scenario, è consigliato un approccio privo di DNA al fine di evitare possibili integrazioni che potrebbero promuovere la trasformazione. Inoltre, l’approccio “mordi e fuggi” riduce la possibilità di effetti indesiderati fuori bersaglio. È necessario un maggiore impegno al fine di sviluppare specifici sistemi di consegna che avrebbe aperto nuove strade per il trattamento delle malattie ematologiche maligne e benigne.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalla prevenzione del cancro e Istituto di ricerca del Texas (RP160283, RP140001 e R1201), Angel Foundation di Gabrielle per la ricerca sul cancro, la Fondazione di Edward P. Evans e il NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, CA193235 e DK107413). M.C.G è supportato da Baylor sostiene la ricerca per gli scienziati dell’allievo. Citometria a flusso è stata parzialmente sostenuta dal NIH (centro nazionale per le risorse di ricerca grant S10RR024574, Istituto nazionale dell’allergia e AI036211 di malattie infettive e National Cancer Institute P30CA125123) per il Baylor College of Medicine Cytometry e Cell Sorting Core.
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |