Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical
Summary
Se describe un protocolo para exponer quirúrgicamente y estabilizar la glándula salival submaxilar murina intravital imagen usando microscopia intravital vertical. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras glándulas exocrinas de la cabeza y región del cuello de los ratones y otros roedores pequeños.
Abstract
La glándula salival submaxilar (SMG) es una de las tres glándulas salivales mayores y es de interés para muchos campos distintos de investigación biológica, como Inmunología, oncología, odontología y biología de la célula. El SMG es una glándula exocrine conformada por células epiteliales secretoras, miofibroblastos, células endoteliales, los nervios y matriz extracelular. Procesos celulares dinámicos en la rata y el ratón SMG anteriormente han sido reflejados, sobre todo usando invertido sistemas multi-photon microscopio. Aquí, describimos un protocolo sencillo para la preparación quirúrgica y la estabilización del SMG murino en ratones anestesiados para imágenes en vivo con los sistemas vertical microscopio del multi-photon. Presentamos juegos imagen representativa intravital de endógeno y eventualmente transferido células fluorescentes, incluyendo el etiquetado de los vasos sanguíneos o los conductos salivales y segunda harmónica para visualizar colágeno fibrilar. En suma, nuestro protocolo permite para preparación quirúrgica de glándulas salivales de ratón en los sistemas de microscopía vertical, que comúnmente se utilizan para la proyección de imagen intravital en el campo de la inmunología.
Introduction
Saliva es secretada por las glándulas exocrinas para lubricar el alimento, proteger las superficies mucosas del tracto oral y entregar las enzimas digestivas, así como sustancias antimicrobianas1,2. Además de las glándulas salivales menores se entremezclan en la submucosa oral, hay tres sistemas bilaterales de glándulas mayores que parótida, sublingual y submaxilar, se denominará según su ubicación1,2. Las células epiteliales en forma de pirámide, organizada en sacos en forma de matraz (acinos) o semilunas que están rodeadas por células mioepiteliales y una membrana del sótano, secretan los componentes serosos y mucosos de saliva1. Estrecho espacio luminal de los acinos drena en los conductos intercalados, que se unen en conductos estriados hasta que finalmente se unen en un conducto excretor único1. El conducto excretor principal del SMG se llama conducto de Wharton (WD) y se abre en la carúncula sublingual3,4. El compartimiento epitelial SMG por lo tanto representa una estructura altamente arborized con múltiples terminales terminal, que se asemeja a un paquete de uvas1,5,6. El intersticio SMG está compuesto por vasos sanguíneos y linfáticos embebidos en tejido conjuntivo7 que contiene nervios parasimpáticos8 y5de la matriz extracelular. Glándulas salivales normales de humanas y roedores también contienen células T, macrófagos y células dendríticas9, así como las células plasmáticas que secretan inmunoglobulina A (IgA) en la saliva9,10. Debido a sus múltiples funciones en salud y enfermedad, el SMG es un tema de interés para muchos campos de investigación biológica, incluyendo odontología4Inmunología11, Oncología12,8de fisiología y biología celular 3.
Proyección de imagen de interacciones y procesos celulares dinámicos es una poderosa herramienta en la investigación biológica13,14. El desarrollo de tejido profundo imágenes e innovaciones inmicroscopes basado en óptica no lineal (RNE), que se basan en la dispersión o absorción de fotones múltiples por parte de la muestra, ha permitido para examinar directamente los procesos celulares en los tejidos complejos13 ,15. Absorción de fotones múltiples implica la entrega de la energía de excitación total por los fotones de baja energía, que excitación del fluoróforo confines al plano focal y por lo tanto permite una penetración más profunda del tejido con fotodaño reducida y ruido fuera de foco excitación de13,15. Este principio se emplea por microscopia de dos fotones (14:00) y permite obtener imágenes de muestras fluorescentes en profundidades de hasta 1 mm15,16. Mientras comercialmente disponibles 14:00 las configuraciones se han convertido en fácil de usar y confiable, el principal desafío para la proyección de imagen intravital es exponer y estabilizar el órgano Diana de ratones anestesiados, especialmente para la proyección de imagen de serie de lapso de tiempo. Varios métodos para la corrección de deriva digital después de adquisición de datos han sido publicaron17,18 y recientemente desarrollado “VivoFollow”, un sistema de corrección automática que contrarresta la deriva lenta del tejido en tiempo real usando un computarizado de la etapa19. Sin embargo, es aún crítico para alta calidad de imagen para reducir al mínimo el movimiento del tejido, especialmente los movimientos rápidos causados por respiración o del latido del corazón19. Se han publicado procedimientos de preparación y estabilización de múltiples órganos, incluyendo médula espinal20, hígado21, piel22, pulmón23y24de nodo de linfa. Además, los modelos para la proyección de imagen de la glándula salival rata han sido desarrolladas3,25 y perfeccionado para intravital proyección de imagen de alta resolución de murine que SMG adaptada a un microscopio invertido configuración26, 27 , 28.
Aquí, presentamos un protocolo práctico y adaptable para la proyección de imagen intravital de la SMG murino mediante microscopía no lineal vertical, que es comúnmente utilizado para la proyección de imagen intravital en el campo de la inmunología. Para ello, modificamos una etapa de inmovilización empleada ampliamente utilizada para las preparaciones de ganglio poplíteo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ofrece un enfoque sencillo para obtener imágenes en vivo de murinas submaxilar y sublinguales glándulas salivales mediante microscopía no lineal vertical de uso frecuente en el campo de la inmunología. El método puede adaptarse para la proyección de imagen de otras glándulas exocrinas en la región de cabeza y cuello. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha realizado la proyección de imagen de la glándula lacrimal en una manera análoga (no mostrada).
Eliminar el t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza (SNF) proyecto grant 31003A_135649, 31003A_153457 y 31003A_172994 (a joint ventures) y Leopoldina Beca 2011 LPDS-16 (BS). Este trabajo de configuraciones ópticas del “Microscopia Imaging Center” (MIC) de la Universidad de Berna.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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