In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Methodik zur Analyse des Genotyps C924T. Das Protokoll besteht aus drei Phasen: DNA-Extraktion, Verstärkung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Analyse von der Beschränkung Fragment-Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarosegel.
Das Thromboxan A2-Rezeptor (TBXA2R)-gen ist ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten-Superfamilie mit sieben-Transmembranproteins Regionen. Es ist in der Atherogenese fortschreiten, Ischämie und Myokardinfarkt beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methodik der Patienten Genotypisierung posttranskriptionale Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3′ Region des TBXA2-Rezeptor-Gens zu untersuchen. Diese Methode beruht auf DNA-Extraktion aus Vollblut, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verstärkung der TBXA2 gen Teil enthält die C924T-Mutation und Identifizierung von Wildtyp und/oder mutierten Genotypen mit einer Restriktionsanalyse verdauen, insbesondere eine Beschränkung Fragment Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarose-gel. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse durch das TBXA2R Gen Sequenzierung bestätigt. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie hohe Effizienz und die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus von PCR und Restriktionsenzym Analyse. Dieser Ansatz ermöglicht eine vorausschauende Studie für die Bildung von Plaque und Progression der Atherosklerose durch die Analyse von Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus. Anwendung dieser Methode hat das Potenzial, Themen zu identifizieren, die anfälliger für atherothrombotischer Prozesse in bestimmten Fächern in einer Gruppe mit hohem Risiko, Aspirin behandelt werden.
TBXA2R ist Mitglied der G-Protein-gekoppelten-Superfamilie mit sieben-Transmembranproteins Regionen, die allgemein ausgedrückt und lokalisiert die Zellmembranen oder auf intrazelluläre Strukturen1,2. TBXA2R-Signalweg ist an fortgeschrittene atherosklerotische Prozesse3beteiligt. Erhöhte Expression des TBXA2-Rezeptors wurde während der Atherogenese Progression nachgewiesen und klinische und experimentelle Studien zeigten seine wichtige Rolle in Ischämie und Myokardinfarkt4. C924T, ein Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) des TBXA2R-Gens wurde als eine funktionale Polymorphismus bei gesunden Probanden erkannt und zu klinischen Erkrankungen5verknüpft wurde. Darüber hinaus nachweislich unsere vorherigen Studie6 Transkript Stabilität der C924T Polymorphismus des TBXA2R-Gens beteiligt ist; insbesondere ist eine erhöhte Instabilität der mutierten (TT) Typ Abschrift gegenüber dem Wildtyp (CC). Darüber hinaus induzierte mehrere Reize wie Adenosin-diphosphat (ADP), Epinephrin und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen Thrombozytenaggregation weniger wirksam für den mutierten Typ (TT). Dies steht im Einklang mit einer reduzierten Thrombusbildung und Blutstillung. So könnte die Instabilität der TBXA2R Abschrift und die damit verbundene Reduktion der Thrombozytenaggregation eine Schutzfunktion für die TBXA2R TT-Genotyp gegen Atherothrombosis und seine Komplikationen bei Patienten mit hohem Risiko Aspirin behandelt6 zugeordnet sein .
Hier beschreiben wir eine Methodik für die Patienten Genotypisierung posttranskriptionale Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3′ Region des TBXA2-Rezeptor-Gens zu untersuchen. Diese Methode beruht auf den folgenden Schritten: (1) DNA-Extraktion aus Vollblut, (2) PCR Verstärkung der TBXA2R gen Teil mit der C924T-Mutation, und (3) Ermittlung der Wildtyp und/oder mutierten Genotypen mit Beschränkung Fragment-Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarosegel. RFLP ist eine Technik, die Variationen in homologen DNA-Sequenzen7nutzt. Diese Anwendung wurde DNA-Polymorphismen, vor allem SNPs zu erkennen und zu finden und zuordnen biologische Relevanz Genvariationen8verwendet. Polymorphismus, die zum ersten Mal mit der RFLP-PCR in Menschen analysiert wurde die ABO-Blut-9. Die RFLP-PCR-Methode ermöglicht die Analyse von genetischen Mutationen in homologen DNA-Sequenzen durch die Anwesenheit von Fragmenten unterschiedlicher Längen nach der DNA-Verdauung mit hochspezifischen Beschränkung Endonucleases10auswerten.
In vergangenen Jahren, die folgenden Methoden sind verwendet worden für die SNP-Analyse mit Hilfe der PCR-Technik: Hybridisierung von kurzen Allel-spezifische Oligonukleotide11, Allel-spezifische PCR12, Grundierung Erweiterung auf DNA-Microarrays13, Oligonukleotid Ligatur assay14, direkte DNA Sequenzierung für identifizierende Position-spezifische Einzel-Nukleotid-Polymorphismen15, Taqman-Methode16, Extraktion Matrix Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) MALDI-TOF) Massenspektrometrie17und Genchip18. Diese Techniken sind nicht einfach zu bedienen und erfordern teure Ausrüstung. Umgekehrt, die PCR-RFLP-Methode ist kostengünstig, einfach zu bedienen, bequem, hat einen hohen Wirkungsgrad und ermöglicht die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus. Darüber hinaus haben wir die Ergebnisse durch Sequenzierung des TBXA2R-Gens mit der Sanger-Methode15bestätigt.
Dieser Ansatz ermöglicht eine prädiktive Untersuchung der Plaquebildung und Progression der Atherosklerose durch die Analyse von Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus. Diese Methode könnte Themen anfälliger für atherothrombotischer Prozesse, insbesondere diejenigen unter risikoreichen, Aspirin-behandelten Patienten identifizieren.
In der vorliegenden Studie haben wir eine Methode beschrieben, mit dem Patienten Genotypisierung um die posttranskriptionelle Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3′ Region des TBXA2R-Gens zu untersuchen können. Erstens setzt diese Methode auf DNA-Extraktion aus dem Vollblut. Insbesondere besteht dieser ersten Prozess der Reinigung der gesamten menschlichen DNA, genomische und mitochondriale aus Vollblut-Proben, frisch oder gefroren, mit EDTA (Zitrat oder Heparin) behandelt. Für kurzfristige Lagerung von Vollblut-Proben für bis zu 10 Tagen bei 2 bis 8 ° C lagern. Für die Lagerung speichern Sie über 10 Tage Proben bei-70 ° C. Die automatisierte Reinigung erfolgt in 4 Schritten: lysiert, binden, waschen und eluieren. Zweitens setzt die Methode auf PCR Verstärkung der TBXA2R gen Teil enthält die C924T-Mutation. Schließlich erfolgt die Identifizierung der Wildtyp und/oder mutierten Genotyp mit einem Restriktionsenzym Analyse (RFLP) auf Agarosegel.
Wichtige Schritte im Protokoll sind die folgenden: (i) In dem Fall, die ein Teil der Agarosegel bei gelagert RT verwendet, die erstarrten Agarose kann über dem kochenden Wasserbad (bei 60 ° C für ca. 15-20 min) wieder aufgelöst oder in der Mikrowelle (3-5 min) vor dem Gießen. Hinweis: lösen Sie die Kappe beim Agarose in einer Flasche wieder schmelzen. (Ii), darüber hinaus bei der Agarose, Nacherwärmung Verdunstung eine Erhöhung der Konzentration bewirkt. Aus diesem Grund wäre es nützlich, indem man eine kleine Menge Wasser zu kompensieren. (Iii) DNA-Fragmente von weniger als 1.000 bp waren unterscheiden sich durch Agarosegel und TBE-Puffer wird empfohlen, die beste mögliche Trennung zu erhalten. (iv) wir lieber ein Agarosegel, anstatt ein Polyacrylamid-Gel zu verwenden, da die Zubereitung des letzteren schwieriger ist, und es viel länger dauert einzurichten. (V) die Wahl der Laufzeit die Gelelektrophorese stützt sich auf die erwartete Größe der Amplifikationsprodukte. Basierend auf dieses Protokoll, ist es ausreichend, eine Elektrophorese für 20-30 min bei 100 V in 2 % Agarosegel durchführen, da die Größe der PCR-Fragmente reicht von 100 bis 500 BP (vi). es ist zwingend erforderlich, um 10 bis 50 erhalten ng eine gute Vorlage aus humanen Proben extrahierte DNA . Aus diesem Grund bevorzugen wir eine automatisierte DNA Reinigung eher als ein semi-automatisch oder manuell. (Vii) bereiten Sie die Master-Mix Reaktion für PCR-Amplifikation und die Master-Mix-Lösung für PCR-Produkte Verdauung, Hinzufügen von 10 % mehr (um Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren berücksichtigen), das Volumen berechnet, multipliziert mit der Anzahl der Proben für die benötigte Menge für eine DNA-Probe.
Die häufigste Falle der Methode ist das Vorhandensein von zusätzlichen Amplifikationsprodukte aufgrund einer falschen Thermocycler-Programm, eine falsche Verstärkung-Master-Mix-Vorbereitung oder eine DNA-Vorlage-Kontamination. Darüber hinaus möglicherweise das Fehlen der PCR-Produkte aufgrund von inaktivierten Taq Polymerase oder eine falsche Thermocycler ausgeführt. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von unerwarteten Fragmente durch PCR-Produktverschmutzung oder durch eine unvollständige Verdauung von inaktivierten Enzyms, zu wenig Restriktionsenzym Volumen oder eine zu kurze Inkubationszeit sein.
In den letzten Jahren haben die folgenden Methoden für die SNP-Analyse mit Hilfe der PCR-Technik verwendet worden: Hybridisierung von kurzen Allel-spezifische Oligonukleotide11, Allel-spezifische PCR12, Grundierung Erweiterung auf DNA-Microarrays13 , Oligonukleotid Ligatur assay14, direkte DNA-Sequenzierung zur Identifizierung von Position-spezifische Einzel-Nukleotid-Polymorphismen15, Taqman-Methode16, Extraktion Matrix Laser Desorption/Ionisierung Time-Of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie17und Genchip18. Diese Methoden sind nicht ideal, denn sie nicht einfach sind zu verwenden und/oder teure Ausrüstung erfordern. Umgekehrt, die in dieser Studie beschriebene PCR-RFLP-Methode ist kostengünstig, einfach zu bedienen, bequem, hat einen hohen Wirkungsgrad und ermöglicht die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus. Eine Beschränkung auf das vorliegende Verfahren ist, dass es nur für eine kleine Anzahl von SNPs und ein paar Proben in einer Arbeitssitzung verwendet werden kann.
Für zukünftige Anwendungen kann diese Methode für prädiktive Untersuchungen in Bezug auf Bildung von Plaque und Progression der Atherosklerose durch die Analyse der Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus verwendet werden. Darüber hinaus könnte diese Methode Themen anfälliger für atherothrombotischer Prozesse identifizieren, insbesondere Risikopatienten mit Aspirin behandelt. Schließlich könnten diese Methode angewandt werden, um andere Polymorphismen in der personalisierten Medizin für bestimmte Medikamente (z. B. Antikoagulantien und Antikonvulsiva) Beteiligten zu studieren, um zu verstehen, die geeignete Dosierung und den einzelnen pharmakologischen und klinisches Ansprechen für jeden Patienten vor Beginn der Therapie und Nebenwirkungen zu vermeiden.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wurde teilweise um 60 % finanziert, die Ateneo von Ministero Dell’Università, Italien, S.M. und E.T. gewährt Wir haben auch teilweise Beiträge Aufwendungen durch die Abteilung für medizinische, Oral und biotechnologischen Wissenschaften, Universität von Chieti “G. d ‘ Annunzio” Forschung erhalten.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |