वर्तमान अध्ययन में, हम एक पद्धति का वर्णन करने के लिए C924T जीनोटाइप का विश्लेषण । प्रोटोकॉल के तीन चरण होते हैं: डीएनए निष्कर्षण, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धन, और प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई पोलीमरेज़ (आरएफएलपी) के विश्लेषण एग्रोस जेल पर ।
Thromboxane A2 रिसेप्टर (TBXA2R) जीन जी प्रोटीन युग्मित superfamily के सात-transmembrane क्षेत्रों के साथ एक सदस्य है । यह atherogenesis प्रगति, ischemia, और मायोकार्डल रोधगलन में शामिल है । यहां हम रोगी जीनोटाइपिंग की एक पद्धति के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2 रिसेप्टर जीन के 3 क्षेत्र में स्थित-transcriptional भूमिका की जांच करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस विधि पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण पर निर्भर करता है, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) C924T उत्परिवर्तन युक्त TBXA2 जीन भाग के प्रवर्धन, और जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती जीनोटाइप की पहचान एक प्रतिबंध डाइजेस्ट विश्लेषण का उपयोग कर, विशेष रूप से एक प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई अग्रासे जेल पर बहुरूपता (rflp) । इसके अलावा, परिणाम अनुक्रमण द्वारा TBXA2R जीन की पुष्टि की गई । इस विधि कई संभावित लाभ, जैसे उच्च दक्षता और C924T बहुरूपता की तेजी से पहचान पीसीआर और प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण द्वारा सुविधाएँ. इस दृष्टिकोण TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति के लिए एक भविष्यसूचक अध्ययन की अनुमति देता है । इस विधि के आवेदन में एक उच्च जोखिम, aspirin-उपचारित समूह में विशेष विषयों में, जो अधिक atheroथ्रोनबोटिक प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं विषयों की पहचान करने की क्षमता है ।
TBXA2R सात-transmembrane क्षेत्रों के साथ जी प्रोटीन युग्मित superfamily के एक सदस्य है, जो व्यापक रूप से व्यक्त कर रहे है और या तो कोशिका झिल्ली पर या intracellular संरचनाओं1,2पर स्थानीयकृत । TBXA2R सिग्नलिंग मार्ग उन्नत atherosclerotic प्रक्रियाओं3में शामिल है । TBXA2 रिसेप्टर की वृद्धि की अभिव्यक्ति atherogenesis प्रगति के दौरान प्रदर्शन किया गया था, और नैदानिक और प्रायोगिक अध्ययन ischemia और मायोकार्डल रोधगलन4में अपनी प्रासंगिक भूमिका दिखाई । C924T, एक एकल न्यूक्लिओटाइड बहुरूपता (snp) TBXA2R जीन की, स्वस्थ स्वयंसेवकों में एक कार्यात्मक बहुरूपता के रूप में पहचाना गया था और नैदानिक विकारों से जोड़ा गया है5. इसके अलावा, हमारे पिछले6 अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि TBXA2R जीन के C924T बहुरूपता ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता में शामिल है; विशेष रूप से, वहां उत्परिवर्ती (टीटी) प्रकार प्रतिलिपि के जंगली प्रकार (सीसी) के संबंध में एक वृद्धि की अस्थिरता है । इसके अलावा, कई उत्तेजनाओं जैसे adenosine डाइफॉस्फेट (adp), epinephrine, और कोलेजन अलग सांद्रता पर एक प्लेटलेट एकत्रीकरण उत्परिवर्ती प्रकार (टीटी) के लिए कम प्रभावी प्रेरित । यह एक कम थक्का गठन और रक्तस्तस्कता के साथ संगत है । इस प्रकार, TBXA2R ट्रांसक्रिप्ट की अस्थिरता और प्लेटलेट एकत्रीकरण की संबंधित कमी एथेरोथ्रोंबोसिस के खिलाफ TBXA2R TT जीनोटाइप के लिए एक सुरक्षात्मक भूमिका के साथ जुड़ा हो सकता है और उच्च जोखिम एएप्जिन में इसकी जटिलताओं-रोगियों का इलाज6 .
यहां, हम रोगी जीनोटाइपिंग के लिए एक पद्धति का वर्णन के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2 रिसेप्टर जीन के 3 क्षेत्र में स्थित-transcriptional भूमिका की जांच । इस विधि निंन चरणों पर निर्भर करता है: (1) पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण, (2) TBXA2R जीन C924T उत्परिवर्तन युक्त भाग के पीसीआर प्रवर्धन, और (3) जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती जीनोटाइप की पहचान प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई का उपयोग अग्रोसे जेल (ऐगेरोस gel)-पर पॉलीमॉर्फीज्म (rflp) । RFLP एक तकनीक है कि समजातीय डीएनए अनुक्रम में बदलाव का शोषण7है । इस आवेदन डीएनए polymorphisms का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, विशेष रूप से SNPs, और खोजने के लिए और आनुवंशिक रूपों में जैविक प्रासंगिकता सहयोगी8. बहुरूपता पहली बार मानव में rflp-पीसीआर का उपयोग करने के लिए विश्लेषण abo रक्त9था । आरएफएलपी-पीसीआर विधि, उच्च विशिष्ट प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिसेस10का उपयोग करते हुए डीएनए पाचन के बाद विभिन्न लंबाई के टुकड़ों की उपस्थिति का मूल्यांकन करके समजातीय डीएनए दृश्यों में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देता है ।
पिछले वर्षों में, पीसीआर तकनीक का उपयोग करते हुए एसएनपी विश्लेषण के लिए निम्नलिखित पद्धतियों का उपयोग किया गया है: शॉर्ट एलील-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाईड्स का संकरण11, एलील-विशिष्ट पीसीआर12, डीएनए माइक्रोसरणियों पर प्राइमर एक्सटेंशन13, ओलिगोन्यूक्लिओटाइड कोलेशन परख14, स्थिति की पहचान करने के लिए प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण-विशिष्ट एकल-न्यूक्लिओटाइड बहुरूपताओं15, taqman विधि16, निष्कर्षण मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान ( माल्डी-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री17, और genechips18. इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सरल नहीं है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता हो सकती है । इसके विपरीत, पीसीआर-RFLP विधि सस्ती है, उपयोग करने के लिए सरल, सुविधाजनक, एक उच्च दक्षता है, और C924T polymorphism की तेजी से पहचान की अनुमति देता है । इसके अलावा, हम TBXA2R जीन sanger विधि का उपयोग कर15अनुक्रमण द्वारा परिणामों की पुष्टि की ।
यह दृष्टिकोण TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति का एक भविष्य कहनेवाला अध्ययन की अनुमति देता है । इस विधि विषयों की पहचान कर सकता है और अधिक अथरोथ्रोनबोटिक प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील, विशेष रूप से उच्च जोखिम के बीच उन, aspirin-रोगियों का इलाज किया ।
वर्तमान अध्ययन में, हम एक पद्धति का वर्णन किया है कि रोगी जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2R जीन के 3 क्षेत्र में स्थित के बाद-transcriptional भूमिका की जांच । सबसे पहले, इस विधि पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण पर निर्भर करता है । विशेष रूप से, इस पहली प्रक्रिया में कुल मानव डीएनए, जीनोमिक और माइटोकोड्रियल का शुद्धिकरण होता है, जो पूरे रक्त नमूनों से ताजा या जमे हुए, EDTA (या तो सिट्रेट या हेपरिन) के साथ व्यवहार किया जाता है । पूरे रक्त नमूनों की अल्पावधि भंडारण के लिए, 10 दिनों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 10 दिनों में भंडारण के लिए-७० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान । स्वचालित शुद्धि प्रक्रिया 4 कदम शामिल हैं: lyse, बांध, धोने, और elute । दूसरा, विधि TBXA2R जीन C924T उत्परिवर्तन युक्त भाग के पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करता है । अंत में, जंगली प्रकार की पहचान और/या उत्परिवर्ती जेनोटाइप का उपयोग कर एक प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण (आरएफएलपी) ऐगेरोज़ जेल पर किया जाता है ।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निंनलिखित हैं: (i) इस मामले में है कि ऐगेरोस जेल के एक हिस्से में आरटी पर संग्रहीत किया जाता है, जम ऐगेरोस फिर से एक उबलते पानी स्नान पर भंग किया जा सकता है (के बारे में 15-20 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर) या एक माइक्रोवेव ओवन (3-5 मिनट) में डालने से पहले । नोट: टोपी ढीला जब एक बोतल में फिर से पिघलने ऐगेरोस । (पप) इसके अतिरिक्त, जब आगरज को पुनः गर्म करना हो तो वाष्पीकरण से उसकी सांद्रता में वृद्धि होगी । इस कारण से, यह पानी की एक छोटी मात्रा जोड़कर क्षतिपूर्ति करने के लिए उपयोगी हो सकता है । (iii) १,००० बीपी से कम के डीएनए अंशों को अग्रोस जेल द्वारा विभेदित किया गया था, और TBE बफर को सर्वोत्तम संभव पृथक्करण प्राप्त करने की सिफारिश की गई है । (iv) हम polyacrylamide जेल के बजाय एक एगरोस जेल का उपयोग करना पसंद करते है क्योंकि बाद की तैयारी अधिक कठिन है, और इसे स्थापित करने के लिए अधिक समय लगता है । (v) जेल वैद्यु-संचलन के चलने के समय का चुनाव प्रवर्धन उत्पादों के प्रत्याशित आकार पर निर्भर करता है । इस प्रोटोकॉल के आधार पर, यह 20-30 मिनट के लिए एक ट्रो के लिए १०० V में 2% ऐगेरोस जेल में प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है, के बाद से पीसीआर अंशों का आकार 100-500 bp से पर्वतमाला । (vi) मानव नमूनों से निकाली गई अच्छी गुणवत्ता वाले टेम्पलेट डीएनए की 10 से ५० एनजी प्राप्त करना अनिवार्य है । . इस कारण से, हम एक अर्द्ध स्वचालित या मैनुअल एक के बजाय एक स्वचालित डीएनए शुद्धि का उपयोग करना पसंद करते हैं । (vii) पीसीआर प्रवर्धन के लिए मास्टर-मिक्स अभिक्रिया और पीसीआर उत्पादों के लिए मास्टर-मिक्स समाधान, पाचन के लिए 10% अधिक (पिख्ता के दौरान द्रव के नुकसान के लिए) की गणना की गई मात्रा के लिए आवश्यक मात्रा के नमूनों की संख्या को जोड़कर तैयार करें । एक डीएनए नमूने के लिए ।
विधि का सबसे अक्सर नुकसान एक गलत थर्मल cycler कार्यक्रम, एक गलत प्रवर्धन मास्टर-मिक्स तैयारी, या एक डीएनए टेम्पलेट संदूषण के कारण अतिरिक्त प्रवर्धन उत्पादों की उपस्थिति है । इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों की अनुपस्थिति निष्क्रिय Taq पोलीमरेज़ या एक गलत थर्मल cycler चलाने के कारण हो सकता है । इसके अलावा, अप्रत्याशित टुकड़े की उपस्थिति पीसीआर उत्पाद संदूषण के कारण या तो एक निष्क्रिय एंजाइम से एक अपूर्ण पाचन के लिए हो सकता है, प्रतिबंध एंजाइम की मात्रा की बहुत कम राशि, या एक बहुत कम ऊष्मायन समय.
पिछले वर्षों में, पीसीआर तकनीक का उपयोग करते हुए एसएनपी विश्लेषण के लिए निम्नलिखित पद्धतियों का उपयोग किया गया है: शॉर्ट एलील-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाईड्स का संकरण11, एलील-विशिष्ट पीसीआर12, प्राइमरी एक्सटेंशन डीएनए माइक्रोसरणियों पर13 , ओलिगोन्यूक्लिओटाइड बंधाव परख14, स्थिति की पहचान करने के लिए प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण-विशिष्ट एकल-न्यूक्लिओटाइड बहुरूपताओं15, taqman विधि16, निष्कर्षण मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान (माल्डी-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री17, और genechips18. ये विधियां आदर्श नहीं है क्योंकि वे उपयोग करने के लिए सरल नहीं है और/या महंगे उपकरणों की आवश्यकता है । इसके विपरीत, पीसीआर-RFLP इस अध्ययन में वर्णित विधि सस्ती है, उपयोग करने के लिए सरल, सुविधाजनक, एक उच्च दक्षता है, और C924T polymorphism की तेजी से पहचान की अनुमति देता है । वर्तमान पद्धति के लिए एक सीमा है कि यह केवल SNPs की एक छोटी संख्या के लिए और एक काम सत्र में कुछ नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, इस विधि TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति के विषय में भविष्यसूचक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि विषयों की पहचान कर सकता है और अधिक atherothrombotic प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील, विशेष रूप से, उच्च जोखिम वाले रोगियों aspirin के साथ इलाज किया । अंत में, इस विधि विशिष्ट दवाओं के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा में शामिल अन्य बहुरूपताओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, थक्का-रोधी और antiआक्षेपग्रस्त) ताकि उचित दवा खुराक और व्यक्तिगत औषधीय समझने के लिए और चिकित्सा शुरू करने से पहले प्रत्येक रोगी के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया और प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए.
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को आंशिक रूप से ६०% द्वारा वित्त पोषित किया गया था Ministero Dell ‘ Università, इटली से एस. एम. ए., और एट के Ateneo अनुदान हम भी चिकित्सा, मौखिक और जैव प्रौद्योगिकी विज्ञान, Chieti के विश्वविद्यालय “जी डी ‘ Annunzio” द्वारा अनुसंधान व्यय के लिए आंशिक योगदान प्राप्त किया ।
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |