I denna studie, beskriver vi en metod för att analysera C924T genotypen. Protokollet består av tre faser: DNA-extraktion, förstärkning av polymeras-kedjereaktion (PCR) och analys begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel.
Tromboxan A2 receptor (TBXA2R) genen är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner. Det är involverade i aterogenes progression, ischemi och hjärtinfarkt. Här presenterar vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3′ regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod, polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning av den TBXA2 gen del innehåller C924T mutation och identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper använder en begränsning digest analys, specifikt en begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agaros gel. Dessutom bekräftades resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R. Denna metod har flera potentiella fördelar, såsom hög effektivitet och snabb identifiering av den C924T polymorfism genom PCR och restriktionsenzym analys. Denna metod tillåter en förutsägande studie för plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Tillämpning av denna metod har potential att identifiera individer som är mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i särskilda ämnen i en högrisk, aspirin-behandlade.
TBXA2R är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner, som är allmänt uttryckt och lokaliserade på cellmembranen eller intracellulära strukturer1,2. Den TBXA2R signalvägen är involverade i avancerade aterosklerotiska processer3. Ökat uttryck av TBXA2 receptorn var visat under aterogenes progression, kliniska och experimentella studier visade dess relevanta roll i ischemi och hjärtinfarkt4. C924T, en single nucleotide polymorphism (SNP) av genen TBXA2R, erkändes som en funktionell polymorfism hos friska frivilliga och har kopplats till kliniska sjukdomar5. Dessutom visat vår tidigare studie6 att den C924T polymorfism av genen TBXA2R är inblandade i avskrift stabilitet. specifikt, finns det en ökad instabilitet av mutant (TT) typ utskriften med avseende på den vilda typen (CC). Dessutom inducerade flera stimuli som adenosindifosfat (ADP), epinefrin och kollagen vid olika koncentrationer en trombocytaggregation mindre effektiv för den muterade typ (TT). Detta är förenligt med en nedsatt tromb bildandet och hemostas. Således, instabiliteten i TBXA2R avskriften och associerade minskning av trombocytaggregation kan vara associerad med en skyddande roll för TBXA2R TT genotypen mot aterotrombos och dess komplikationer hos patienter behandlade med acetylsalicylsyra högrisk6 .
Här, beskriver vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3′ regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på följande steg: (1) DNA-extraktion från helblod, (2) PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutation, och (3) identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper med begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel. RFLP är en teknik som utnyttjar variationer i homologa DNA sekvenser7. Detta program användes att upptäcka DNA polymorfismer, särskilt SNP, och att hitta och associera biologisk relevans i genetiska variationer8. Den polymorfism analyseras för första gången med RFLP-PCR hos människor var ABO blod9. RFLP-PCR metoden tillåter analys av genetiska mutationer i homologa DNA-sekvenser genom att utvärdera förekomsten av fragment av olika längder efter DNA matsmältningen med mycket specifika begränsning endonucleases10.
I senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, på DNA microarrays13, förlängningen på primer oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA sekvensering för identifierande position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, extraktion () laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight MALDI-TOF) masspektrometri17och GeneChips18. Dessa tekniker är inte enkel att använda och kan kräva dyr utrustning. Däremot metoden PCR-RFLP är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. Dessutom bekräftade vi resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R använder de Sanger metod15.
Denna metod tillåter en förutsägande studie av plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet de bland högrisk, aspirin-behandlade patienter.
I den aktuella studien, har vi beskrivit en metod som gör att patienten genotypning för att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3′ regionen av TBXA2R-genen. Först, denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod. I synnerhet består denna första process av en rening av totala mänskligt DNA, genomisk och mitokondrie, från hela blodprover färska eller frysta, behandlas med EDTA (citrat eller heparin). Kort sikt förvaring av helblod prover, förvaras vid 2-8 ° C i upp till 10 dagar. För lagring under 10 dagar, lagra prover vid-70 ° C. Automatiserad reningsprocessen består av 4 steg: lyse, binda, tvätta och eluera. Andra åberopat metoden PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutationen. Slutligen, identifiering av vildtyp eller muterade genotyp genom en analys av restriktionsenzym (RFLP) agarosgel sker.
Kritiska steg i protokollet är följande: (i) i ärendet som en del av agarosgel lagrade på RT används, stelnad Agarens kan vara åter löst över ett kokande vattenbad (vid 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrovågsugn (3-5 min) innan hälla. Obs: lossa locket när omsmältning agaros i en flaska. (ii), dessutom när åter värme agaros, avdunstning kommer att orsaka en ökning av dess koncentration. Därför kan det vara bra att kompensera genom att lägga till en liten mängd vatten. (iii) DNA fragment av mindre än 1 000 bp var åtskilt av agarosgel och TBE buffert rekommenderas att erhålla bästa möjliga separation. (iv) vi föredrar att använda en agarosgel snarare än en polyakrylamidgel eftersom beredningen av den senare är svårare, och det tar mycket längre tid att ställa in. (v) valet av den rinnande tiden av gelelektrofores är beroende av den förväntade storleken på produkterna som förstärkning. Baserat på detta protokoll, är det tillräckligt att utföra en elektrofores för 20-30 min vid 100 V i 2% agarosgel, eftersom storleken på PCR fragment varierar från 100-500 bp. (vi) är det obligatoriskt att erhålla 10 till 50 ng av en god kvalitet DNA utvinns ur mänskliga prover . Därför föredrar vi att använda en automatiserad DNA-rening snarare än en halvautomatisk eller manuell. (vii) Förbered master-mix reaktionen för PCR-amplifiering och master-mix lösning för PCR-produkter matsmältning, lägga till 10% mer (för att beakta förlust av vätska under pipettering) till volymen beräknas multiplicerat med antalet prover för den volym som krävs för en DNA-provet.
Den vanligaste fallgropen för metoden är förekomsten av extra förstärkning produkter på grund av en felaktig termocykel program, en felaktiga förstärkning master-mix förberedelse eller en DNA mall förorening. Dessutom kan avsaknad av PCR-produkter bero på inaktiverade Taq -polymeras eller en felaktig termocykel kör. Dessutom, kan närvaron av oväntade fragment vara på grund av kontaminering med PCR-produkt eller en ofullständig matsmältning från antingen ett inaktiverat enzym, för lite mängden restriktionsenzym volym eller en alltför kort inkubationstid.
Under de senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, primer filändelsen på DNA microarrays13 , oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA-sekvensering för att identifiera position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, utvinning laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri17, och GeneChips18. Dessa metoder är inte idealiska eftersom de inte är enkel att använda och/eller kräver dyr utrustning. Däremot den PCR-RFLP-metod som beskrivs i denna studie är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. En begränsning till denna metod är att den endast kan användas för ett litet antal SNP och några prover i ett arbetsmöte.
För framtida tillämpningar, kan denna metod användas för förutsägande studier gällande plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera de tålmodiga genotyperna för den TBXA2R C924T polymorfism. Dessutom denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet högriskpatienter behandlas med acetylsalicylsyra. Slutligen, denna metod skulle kunna tillämpas för att studera andra polymorfismer som är inblandade i personlig medicin för specifika läkemedel (t ex antikoagulantia och antiepileptika) för att förstå den lämpliga läkemedel doseringen och individen farmakologiska och kliniskt svar för varje patient innan behandling inleds och att undvika negativa effekter.
The authors have nothing to disclose.
Projektet finansierades delvis av 60% Ateneo bidrag från Ministero dell’Università, Italien att S.M. och E.T. Vi fick också delvis bidrag för att undersöka kostnader av Institutionen för medicin, Oral och bioteknologiska fakulteten, universitetet i Chieti ”G. d’Annunzio”.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |