Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW
Summary
Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.
Abstract
Ao gerar plantas transgênicas, em geral, o objetivo é ter expressão estável de um transgene. Isto requer única intacta de uma integração do transgene, como cópia multi integrações são frequentemente sujeitas a silenciamento de genes. O vetor binário compatível com o Gateway com base em cromossomos artificiais bacterianos (pBIBAC-GW), como outros derivados de pBIBAC, permite a inserção dos transgenes cópia única com alta eficiência. Como uma melhoria para o pBIBAC original, uma gaveta de Gateway foi clonada em pBIBAC-GW, para que as sequências de interesse podem agora ser facilmente incorporadas a transferência de vector DNA (T-DNA) clonando Gateway. Comumente, a transformação com pBIBAC-GW resulta em uma eficiência de 0,2-0,5%, segundo o qual metade dos transgênicos a transportar uma integração de cópia única intacta do T-DNA. Os vetores de pBIBAC-GW estão disponíveis com resistência ao glufosinato-amônio ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente para seleção em plantas e com resistência à canamicina como uma seleção em bactérias. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas usando pBIBAC-GW: a partir de recombinar as sequências de interesse em vetor de escolha, para plantar a transformação com pBIBAC-GW Agrobacterium, seleção dos transgênicos e teste as plantas para integridade e cópia número de inserções usando a DNA mancha. Atenção é dada a concepção de uma estratégia de mancha de DNA para reconhecer integrações de single e multi cópias em único e múltiplos loci.
Introduction
Ao gerar plantas transgênicas, geralmente, o objetivo é ter o transgene integrado estàvel expressa. Isto pode ser conseguido por integrações intacta cópia única de um transgene. Múltiplas integrações podem levar ao aumento da expressão de um transgene, mas também para o silenciamento de genes. Silenciamento de transgenes é mais provável se sequências inseridas são dispostas em tandem ou repetições invertidas1,2,3,4. Vetores binários são usadas como naves em Agrobacterium-mediada experimentos de transformação para entregar as sequências de interesse em genomas de planta. O número de integrações no genoma planta é dependente do número de cópia do vetor binário em Agrobacterium tumefaciens5,6. Muitos vetores binários comumente usados são vetores de alta cópia e, portanto, produzir um número de cópia do transgene média alta: cópias de 3.3 para 4,9 em Arabidopsis5.
O número de integrações de T-DNA pode ser diminuído usando vetores binários que têm um número baixo-cópia em a. tumefaciens, tais como BIBAC7, ou através do lançamento de um T-DNA da . tumefaciens cromossoma5. O número médio de integrações do transgene em tais casos é inferior a 25,8,9,10. Devido a ser cópia única na . tumefaciens e também em Escherichia coli, BIBAC-derivados podem manter e entregar as construções tão grandes quanto 150 kb,11.
Compatível com o GW BIBAC vetores10,12 permitir fácil introdução de genes de interesse para o vetor usando Gateway clonagem. O uso da tecnologia de Gateway simplifica o procedimento de clonagem, mas também supera os problemas comuns associados com13,grandes vetores de baixo-cópia-número14, como um baixo rendimento de DNA e uma seleção limitada de restrição exclusiva sites disponíveis para clonagem de7,11. Os derivados de pBIBAC-GW estão disponíveis com qualquer resistência ao glufosinato-amônio (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente (pBIBAC-RFP-GW) para seleção em plantas (Figura 1)10,12. Para os dois vetores, um gene de resistência canamicina é usado como marcador de seleção em bactérias.
Combinam os vetores de pBIBAC-GW: design (1) fácil e manipulação genética em e. colie integrações de cópia única (2) intacto em planta com alta eficiência. O rendimento de vetores de pBIBAC-GW em integrações de média 1,7 em Arabidopsis com aproximadamente metade das plantas transgênicas carregando um único integrado T-DNA10.
Expressao de transgenes é um requisito para a maioria dos transgênicos gerados. Expressão do transgene estável pode ser conseguida integrações intactas, cópia única. Trabalhar com plantas transgênicas carregando integrações intactas, cópia única é, no entanto, ainda mais importante, se por exemplo, o objetivo é estudar a eficiência de processos baseados em cromatina, tais como recombinação, mutagênese ou reparação e a dependência destes processos no genoma e a estrutura da cromatina no local da inserção. Para nosso interesse, para estudar a dependência de mutagênese do oligonucleotide dirigido (ODM) no contexto genômico do local, um conjunto de linhas de repórter com integrações intactos, cópia única de um gene repórter de mutagénese foi gerado (Figura 2)10. Usando este conjunto de linhas, foi demonstrado que a eficiência ODM varia entre loci transgénicos integrado em diferentes localizações genômicas, apesar dos níveis de expressão do transgene ser bastante semelhante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crítico para a geração de transgênicos com integrações único, intactos de um transgene é a escolha do vetor binário usado. Vetores de família BIBAC têm sido utilizados para entregar muitos planta espécie23,24,25,26,,27,28-sequências de interesses. Vetores BIBAC, incluindo BIBAC-GW, rendem cópia única integraç?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é suportada pelo holandês tecnologia Foundation STW (12385), que faz parte da organização de países baixos para a pesquisa científica (NWO), e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos assuntos económicos (OTP Grant 12385-MS). Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidade de Cornell, Estados Unidos) para a prestação de pCH20, a espinha dorsal dos vetores BIBAC-GW.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
