Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration
Summary
Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.
Abstract
Morphologische Organregeneration nach akuten Gewebeverlust ist häufig bei niedrigeren Wirbeltiere, aber wird selten in Säugetieren postnatale Leben beobachtet. Erwachsenen Leberregeneration nach 70 % teilweise Hepatektomie führt in Hepatozyten Hypertrophie mit einigen Replikation im verbleibenden Lappen mit Wiederherstellung der Stoffwechselaktivität, aber mit dauerhaften Verlust des verletzten Lappens Morphologie und Architektur. Hier zeigen wir eine neue Operationsmethode in der Neugeborenen, die eine physiologische Umgebung förderlich für die Regeneration lässt. Dieses Modell beinhaltet Amputation der linke Lappen Spitze und eine anschließende konservative Verwaltung Regime, und fehlt die Notwendigkeit einer Ligatur der großen Leber Gefäße oder chemischen Verletzungen, so dass eine physiologische Umgebung wo Regeneration stattfinden kann. Wir erweitern dieses Protokoll zu Amputationen an juvenilen (P7-14) Mäusen, bei denen die Geschädigte Leber von Organregeneration in kompensatorischen Wachstum durch Hypertrophie wechselt. Das präsentiert, kurz 30 min-Protokoll sieht einen Rahmen um die Mechanismen der Regeneration, der altersassoziierten Rückgang bei Säugetieren und die Charakterisierung der vermeintlichen hepatische Stiel oder Vorfahren zu studieren.
Introduction
Die Fähigkeit zur Regeneration eines Organs oder zur Wiederherstellung von Form und Funktion, ist gedacht worden, vor allem über die evolutionäre Zeit verloren. Das regenerative Potential der Erwachsenen Säugetier-Leber nach chemischen oder physikalischen akutverletzung wurde gefunden, um die Mobilisierung der alle verbleibenden Hepatozyten in Wellen von Hypertrophie und einige Runden der Zellteilung, wodurch eine funktionale aber was beinhalten architektonisch verschiedenen Orgel1,2,3,4,5. Vor kurzem, haben Studien begonnen, die regenerative Reaktion des Neugeborenen Säugetieren Organe auf eine Verletzung innerhalb der ersten Woche des Lebens6,7,8charakterisieren. Diese Studien haben gezeigt, dass wenn bei Neugeborenen Entwicklung verletzt, bestimmte Säugetiere Organe mit morphologischen Regeneration statt kompensatorische Wachstum oder Fibrose7,8 reagieren.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Regeneration der globalen Struktur und Funktion während der frühen neonatalen Periode6,7,8auftritt. Etablierten Leberschädigung Protokolle beinhalten chemische Verletzungen oder Verwaltung von Ethanol9,10,11, Paracetamol12,13,14,15 , Carbon Titantetrachlorid16,17,18,19, 70 % teilweise Hepatektomie4,20,21oder Entfernung der linken und mittlere Lappen. Chemische Verwaltung führt zum Zelltod Hepatozyten, aber oft Mikro und Makro-Strukturen intakt. Morphologische Regeneration kann nicht ohne weiteres in diesem Zusammenhang untersucht werden, wie die insgesamt hepatische Architektur nicht ausgelöscht wurde. Die 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet Naht Ligatur der großen Gefäße, die Blutung zu stoppen notwendig ist, sondern lässt eine nicht-physiologischen Umgebung mit ständigen Unterbrechungen des Gefäßsystems. Darüber hinaus ist nur mit dieser Methode auf Erwachsene Nagetiere, und ihre Anwendung auf das Neugeborene ist technisch äußerst schwierig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, die in dem 20-30 % von der Spitze des linken Lappens, in einer Neugeborenen Maus P0 entfernt wird entwickelt (Abbildung 1A-1 b). Diese Methode ist chirurgisch konservative, minimal-invasive, nicht technisch anspruchsvoll und führt zum Verlust der Morphologie ohne die Unterbindung des Gefäßsystems, lässt Raum für Regeneration auftreten Brutto. Das resultierende Schritt für Schritt-Protokoll, wie unten beschrieben, ermöglicht für jeden Forscher eine partielle Lobuläres Hepatektomie an Neugeborenen Mäusen durchführen, um Säugetiere neonatale Regeneration in den frühen Stadien des postnatalen Lebens zu studieren. Diese Methode hat auch klare Anwendungen zu vergleichende Studien in der regenerativen Medizin und Stammzellbiologie, wie es in späteren Phasen des Lebens in der Leber verwendet werden kann.
Die häufigste akute Leberschädigung Studien sind chemisch induzierten Schäden, adult Leber Amputation oder 70 % teilweise Hepatektomie. Chemische Schäden oft intravenös, intraperitoneal oder orale Verabreichung von Paracetamol, Carbon Titantetrachlorid oder Ethanol beinhaltet, und ist eine relativ einfache und nicht-invasive Verletzung Modell. Wie bereits diskutiert, chemische Schäden Ergebnisse in Hepatozyten Zelltod, aber oft Blätter Stroma und Parenchym Strukturen intakt, macht es schwierig, Aussagen über morphologische Regeneration machen. Chemische Schäden oft konzentriert sich auf die hepatische Schiffe, so dass es eine nützliche Technik, Website und zellspezifische Verletzungen, studieren aber auch erschwert, kann weiter von Schiffen liegen und das mag, Ebene der gesamten Organs, anderen Populationen zu befragen, zur Regeneration beitragen. Trotz dieser Einschränkungen bleibt chemische Schäden noch eine nützliche und sehr physiologisch relevanten Verletzungen-Modell.
Erwachsene 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet die Entfernung der linken und mittleren Lappen nach Ligatur der hepatischen Gefäßsystem. Die Antwort auf Hepatektomie hat gut charakterisiert: die amputierten Leber 14 Tage Post 70 % teilweise Hepatektomie eine grob Architektur von derjenigen der ursprünglichen unbeschädigt Lappen als die Hepatozyten der verbleibenden rechten und caudatus Lappen entwickelt Hypertrophie und ein paar Runden der Zellteilung4,5zu unterziehen. Dies macht verloren und Funktion, aber schlägt fehl, die beiden amputierten Lappen zu regenerieren und ist daher kein Ersatz für grobe Morphologie. Dadurch eignet sich der Verletzung auf 70 % teilweise Hepatektomie, kompensatorischen Wachstum Mechanismen mit begrenzten Regeneration zu studieren.
Hier beschreiben wir voll und ganz ein Protokoll für eine neonatale teilweise Lobuläres Hepatektomie. Das Verfahren beinhaltet geeignete tierische Auswahl und Vorbereitung, Vorbereitung des Operationsfeldes, Chirurgie und Wiederherstellung. Optimierung und Anpassung der einzelnen Schritte können für verschiedene Anwendungen des Protokolls erforderlich.
Wir haben ausgiebig durchgeführt und optimiert dieses Protokoll auf Wildtyp C57BL/6J Welpen (JAX 000664), jedoch um unterschiedliche Zellpopulationen und Mechanismen der Regeneration zu untersuchen, wir auch verschiedene Transgene Tiere einschließlich Mäuse beherbergen verschiedene Cre verwendet und CreERT2 transgene und/oder Knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, und Sox9CreERT2 JAX 018829) in Kombination mit fluoreszierenden Reporter, wie der Regenbogen und mTmG Systeme (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. fanden wir keine Notwendigkeit, diese Methode für verschiedene Mausstämme ändern, da keine Unterschiede im Überleben Ergebnisse oder regenerative Potenzial beobachtet wurden.
Neben der Verwendung von verschiedener tierischer Stämmen, führten wir auch teilweise lobulären Hepatectomies an Neugeborenen Mäusen mit kleinen Molekülen, wie 4-hydroxy-Tamoxifen und 5-Ethynyl-2 ‘-Deoxyuridine (EdU) behandelt. Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol dienten als Lösungsmittel, da festgestellt wurde, dass Mais-Öl war eine wesentliche Ursache für Morbidität. Ansonsten fanden wir, dass intraperitonealer Verabreichung von kleinen Molekülen nicht überleben oder regenerative Ergebnisse beeinflussen. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen kleinen Molekülen zu verschiedenen Aspekten der Regeneration zu verhören angepasst werden.
Neugeborenen Maus Operationen können technisch anspruchsvoll und erfordern spezielles Know-how im Umgang mit Tieren und mikroskopische Dissektion. Tierhaltung-Kompetenz gilt, mütterliche Kannibalismus zu vermeiden nach der Operation und während der sofortigen Wiederaufnahme Periode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akute Leberschädigung ist traditionell mit chemischen (Paracetamol, Ethanol, Carbon Titantetrachlorid) oder chirurgische Modelle (70 % partielle Hepatektomie) untersucht worden. Die regenerative Antwort nach 70 % teilweise Hepatektomie charakterisiert worden ist, um globale Hepatozyten Hypertrophie und mehrfache Umläufe der Zellteilung4,5einzubinden. Um Blutungen zu stoppen, ist dieses Modell jedoch begrenzt, da die großen Schiffe verlassen eine abnorme Umgebu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken P. Chu zur Durchführung von H & E und Histologie; und C. Wang und A. McCarty für hilfreiche Diskussionen. Forschung wurde unterstützt durch Mittel aus dem Virginia und D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; das National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL058770 und U01HL099999); und California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) Zuschüsse für IW Y.R wurde unterstützt durch die Human Frontier Science Programm Career Development Award (CDA00017), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute, und die Thomas und Stacey Siebel-Stiftung (1119368-104-GHBJI). J.M.T. wurde von der NIH (T32GM007365), der nationalen Forschung Service Award (1F30DK108561), und Paul und Daisy Soros Fellowship für neue Amerikaner unterstützt.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
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