Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור כריתה חלקית של האונה השמאלית הכבד בעכברים neonatal (יום 0). פרוטוקול חדש זה מתאים ללמוד פציעת כבד חריפה ותגובה פציעה בהגדרת neonatal.
Abstract
התחדשות האיברים מורפולוגי בעקבות איבוד רקמות חריפה נפוצה בקרב בעלי חוליות נמוכים יותר, אבל הוא לעיתים נדירות בחיי כמחנכת יונקים. למבוגרים התחדשות הכבד לאחר 70% hepatectomy חלקית תוצאות היפרטרופיה hepatocyte עם כמה שכפול באונות הנותרים שיקום של פעילות חילוף החומרים, אבל עם אובדן קבוע של אדריכלות ומורפולוגיה של האונה פצועים. כאן, אנו מפרטים שיטה כירורגית חדשה ב neonate זה משאיר סביבה הפיזיולוגיות להצטיינות התחדשות. מודל זה כולל כריתה של האונה השמאלית השיא, משטר ניהול שמרנית עוקבות, חסרה את הצורך מצדו של כלי כבד הגדולות או פגיעה כימית, עוזב סביבה הפיזיולוגיות בו התחדשות עלולה להתרחש. אנו להרחיב את פרוטוקול זה כדי כריתות על ילדותי עכברים (P7-14), שבמהלכו הכבד נפגע המעברים של התחדשות האיברים לצמיחה לפיצוי על ידי היפרטרופיה. פרוטוקול שהוצגו, קצר 30 דקות מספק מסגרת כדי ללמוד על מנגנוני התחדשות שלה ירידה גיל-הקשורים ביונקים, אפיון בשם גזע כבדית או אבות.
Introduction
כבר חשבה את היכולת להתחדש איבר, או לשחזר צורה ותפקוד, ללכת לאיבוד בעיקר לאורך זמן אבולוציונית. פוטנציאל הרגנרציה של הכבד יונקים בוגרים לאחר פגיעה חריפה כימיים או פיזיים נמצאה לערב גיוס כל hepatocytes הנותרים וכתוצאה מכך גלים של היפרטרופיה כמה סיבובים של חלוקת התא, וכתוצאה מכך אך פונקציונלי איברים שונים מבחינה ארכיטקטונית1,2,3,4,5. לאחרונה, מחקרים החלו לאפיין את התגובה הרגנרציה של איברים יונקים neonatal לפגיעה בתוך השבוע הראשון של החיים-6,–7,–8. מחקרים אלה הראו כי כאשר נפגע במהלך הפיתוח neonatal, איברים יונקים מסוימים להגיב עם התחדשות מורפולוגי במקום לתת פיצוי הצמיחה או פיברוזיס7,8.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חידוש עולמי מבנה ותפקוד מתרחשת במהלך7,התקופה neonatal6,מוקדמת8. פגיעה בכבד הוקמה פרוטוקולים כרוכה פגיעה כימית או מנהלה של אתנול9,10,11, פרצטמול12,13,14,15 , tetrachloride פחמן16,17,18,19, 70% hepatectomy חלקי4,20,21או הסרה של השמאל, אונות החציוני. ניהול כימי מובילה למוות תא hepatocyte, אבל לעתים קרובות משאיר מיקרו-מאקרו-מבנים שלמים. התחדשות מורפולוגיות לא יכול להילמד ברצון בהקשר זה, כפי הארכיטקטורה הכוללת הכבד לא יצורים שנכחדו. Hepatectomy חלקית 70% כרוך מצדו בתפר של כלי מרכזי, אשר יש צורך לעצור את הדימום, אבל משאיר סביבה שאינם הפיזיולוגיות עם הפרעה קבועה של להערכת. יתר על כן, שיטה זו שימש רק על מכרסמים למבוגרים, היישום שלה כדי neonates טכנית קשה מאוד. עם זאת, פיתחנו שיטת עבודה שבו יוסר 20-30% השיא של האונה השמאלית של עכבר P0 היילוד (איור 1A-1B). שיטה זו בניתוח השמרני, פולשנית, לא באופן טכני מאתגר, ומוביל ברוטו אובדן של מורפולוגיה בלי מצדו של להערכת, השארת מקום התחדשות להתרחש. פרוטוקול צעד אחר צעד וכתוצאה מכך, המתוארים להלן, מאפשרת לכל חוקר לביצוע של hepatectomy lobular חלקית על עכברים neonatal ללימוד בתרבית של התחדשות neonatal בשלבים המוקדמים של החיים אחרי לידה. בשיטה זו יש גם יישומים ברורים השוואתי רפואה רגנרטיבית וביולוגיה תאי גזע, זה יכול לשמש בכבד במהלך ובשלבים מאוחרים יותר של החיים.
המחקרים פציעת כבד חריפה הנפוצים ביותר הם נזק בהשפעת כימיקלים, קטיעה הכבד למבוגרים או 70% hepatectomy חלקית. נזק כימי לעתים קרובות כרוך הניהול תוך ורידי, בקרום הבטן או אוראלי של פרצטמול, tetrachloride פחמן או אתנול, מודל פגיעה קלה יחסית, לא פולשנית. כפי שכבר שוחחנו, גורמת נזק כימי מוות של תאים hepatocyte, אבל לעתים קרובות עלים משתית parenchyma מבנים שלמים, ומקשה על טענות על התחדשות מורפולוגיות. נזק כימי לעיתים קרובות מרכזי על כלי הכבד, שהופך אותו טכניקה שימושית ללמוד באתר תא ספציפי פציעה, אבל גם מקשה לחקור, ברמת כל האיבר, אוכלוסיות אחרות זה יכול להיות ממוקם רחוק יותר מכלי, זה ייתכן לתרום התחדשות. למרות מגבלות אלו, נזק כימי נשאר עדיין מודל שימושי ורלוונטי מאוד מבחינה פיזיולוגית פציעה.
למבוגרים 70% hepatectomy חלקית כרוכה הסרת האונות החציוני ושמאלה בעקבות מצדו של להערכת הכבד. מאפיין היטב בתגובה hepatectomy: הכבד הקטוע 14 ימים פוסט 70% hepatectomy חלקית מפתחת ארכיטקטורת בגסות שונה מזו של האונה ניזוק המקורי, כמו hepatocytes של האונות המזונבת וימינה הנותרים עוברים היפרטרופיה, כמה. סיבובים של חלוקת התא4,5. זה מפצה לאיבוד מסת ותפקוד, אך נכשל להתחדש שתי האונות הקטוע, ולכן אינו מהווה תחליף מורפולוגיה ברוטו. כתוצאה מכך, התגובה פציעה hepatectomy חלקי 70% שימושי ללמוד מנגנוני פיצוי צמיחה התחדשות מוגבלת.
כאן, באופן מלא נתאר עבור hepatectomy lobular חלקית neonatal פרוטוקול. ההליך כרוך הבחירה בעלי חיים המתאים, הכנה, הכנה דימומים, ניתוח ושחזור. אופטימיזציה והתאמה של כל אחד מהצעדים הללו ייתכן שתידרש עבור יישומים שונים של הפרוטוקול.
לנו יש בהרחבה לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה פראי סוג C57BL/6J הגורים (ג’אקס 000664), לעומת זאת, במחקר אוכלוסיות תאים שונים ומנגנונים של התחדשות, השתמשנו גם חיות הטרנסגניים שונות לרבות עכברים מחסה Cre שונים, CreERT2 transgenes ו/או טוק-in (ג’אקסAxin2CreERT2 018867, ו Sox9CreERT2 ג’אקס 018829) בשילוב עם כתבים פלורסנט, כגון מערכות הקשת ו- mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. מצאנו אין צורך לשנות מתודולוגיה זו עבור זנים העכבר שונים, כאשר אין הבדלים תוצאות ההישרדות או פוטנציאל הרגנרציה נצפו.
בנוסף לשימוש זנים בעלי חיים שונים, אנחנו גם לבצע hepatectomies lobular חלקית על neonatal עכברים שטופלו מולקולות קטנות, כגון 4-הידרוקסי-טמוקסיפן ו- 5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine (אדו). דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואתנול שימשו ממיסים, כפי נמצא שכי שמן תירס היה מטרה משמעותית של תחלואה. אחרת מצאנו כי הממשל בקרום הבטן של מולקולות קטנות לא השפיע על הישרדות או תוצאות משובי. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מותאם לשימוש עם מולקולות קטנות אחרות לחקור היבטים שונים של התחדשות.
העכבר neonatal ניתוחים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, מחייבות מומחיות מיוחדת לטיפול בבעלי חיים, ניתוח מיקרוסקופי. גידול בעלי חיים מומחיות יש צורך להימנע קניבליזם אימהית בעקבות הניתוח, במהלך תקופת ההחלמה מיידית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פגיעה כבדית חריפה באופן מסורתי נחקרה באמצעות חומר כימי (פרצטמול, אתנול, פחם tetrachloride), או מודלים כירורגי (70% hepatectomy חלקית). התגובה הרגנרציה לאחר 70% hepatectomy חלקי מאפיין לערב היפרטרופיה hepatocyte הכללית, מספר סיבובים של חלוקת התא4,5. לעצירת דימום, עם זאת, מודל זה היא מוגב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים עמ’ צ’ו לביצוע H & E והיסטולוגיה; וואנג ג. ו א מקארתי לדיונים מועיל. המחקר נתמך באמצעות מימון וירג’יניה ו ד K. לודוויג הקרן לחקר הסרטן; הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL058770 ו- U01HL099999); מכון קליפורניה מענקים רפואה רגנרטיבית (RC1 00354) I.W. Y.R. ונתמך על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הקריירה פיתוח בפרס (CDA00017), קרן מחקר גרמני (2787 RI/1), מכון תאי גזע של Siebel, ו תומאס, סטייסי Siebel קרן (1119368-104-GHBJI). J.M.T. נתמכה על ידי NIH (T32GM007365), בפרס שירות המחקר הלאומית (1F30DK108561), ואת פול דייזי סורוס מלגת האמריקאים החדשים.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
