Частичной гепатектомии лобулярного: Хирургические модель для морфологической регенерации печени
Summary
Здесь мы представляем новый метод для частичной резекции левой доли печени в неонатальной (день 0) мышах. Этот новый протокол подходит для изучения острого повреждения печени и травмы ответ в параметре новорожденных.
Abstract
Морфологических орган регенерации после острого ткани потери распространена среди нижних позвоночных, но редко наблюдается в послеродовой жизни млекопитающих. Взрослый регенерации печени после частичной гепатектомии 70% приводит к гипертрофии гепатоцитов с некоторыми репликации в оставшихся лепестков с восстановлением метаболической активности, но с постоянной потери потерпевшего доли морфологии и архитектуры. Здесь мы подробно новый хирургический метод для новорожденных, что оставляет физиологической среды способствуют регенерации. Эта модель предполагает ампутацию левой доли Апекс и последующих консервативное управление режим и не имеет необходимости перевязки крупных сосудов печени или химические травмы, оставляя физиологической среде, где может возникнуть регенерации. Мы расширяем этот протокол к ампутации на несовершеннолетних (P7-14) мышах, во время которых потерпевшее печени переходит от регенерации органов для компенсации роста, гипертрофия. Представлены, краткие 30 мин протокол обеспечивает основу для изучения механизмов регенерации, его возраст связанных снижение млекопитающих и характеристика предполагаемого печеночная стволовых или прародителями.
Introduction
Способность к регенерации органа, или для восстановления формы и функции, была мысль в основном потеряли эволюции со временем. Было установлено, что регенеративный потенциал взрослых млекопитающих печени после острых химических или физических травм включают мобилизацию всех оставшихся гепатоцитов, волны гипертрофии и несколько раундов деления клеток, что приводит к функциональным но Архитектурноакустически другой орган1,2,3,4,5. Недавно исследования начали характеризовать восстановительной реакции новорожденных млекопитающих органов травмы в течение первой недели жизни6,,78. Эти исследования показали, что когда травму во время развития новорожденных, некоторых млекопитающих органы реагируют с морфологической регенерации вместо компенсации роста или фиброза7,8.
Недавние исследования показали, что глобальные структуры и функции регенерации во время раннего неонатального периода6,,78. Установленные повреждения печени протоколы включают химические травмы или отправления этанола9,10,11, ацетаминофен12,13,14,15 , тетрахлорид углерода16,,1718,19, 70% частичной гепатектомии4,20,21или удаление слева и Средний лопастями. Химические администрация приводит к гибели клеток гепатоцитов, но часто оставляет нетронутыми микро – и макро структур. Морфологическая регенерации не могут быть изучены легко в этом контексте, как целом печеночная архитектуры был не уничтожены. 70% частичной гепатектомии включает перевязки швов крупных сосудов, которая необходима остановить кровотечение, но оставляет не физиологической среды с постоянным нарушением сосудистую. Кроме того этот метод использовался только на взрослых грызунов, и его применение для новорожденных технически очень сложно. Имея это в виду, мы разработали метод, в котором 20-30% верхушки левой доли удаляется в новорожденного P0 мыши (рис. 1A-1В). Этот метод хирургическим консервативная(ый), минимально инвазивной, технически не сложно и приводит к Валовой убыток морфологии без перевязки сосудистую, оставляя место для регенерации происходит. Результате поэтапного протокол, описанные ниже, позволяет любой исследователь для выполнения частичной гепатектомии лобулярного на новорожденных мышей с целью изучения млекопитающих неонатальной регенерации на ранних стадиях послеродовой жизни. Этот метод также имеет четкие приложений для сравнительных исследований в области регенеративной медицины и биологии стволовых клеток, как он может быть использован в печени на более поздних этапах жизни.
Наиболее общие исследования острой травмы печени являются химически индуцированных повреждений, Взрослый печени ампутации или частичной гепатектомии 70%. Химические повреждения часто предполагает внутривенного, внутрибрюшинного или устное администрации ацетаминофен, четыреххлористый углерод, или этанола и относительно легко и неразрушающего травмы модель. Как уже упоминалось, химическое повреждение приводит к клеточной гибели гепатоцитов, но часто листья стромы и паренхиме структуры нетронутыми, что делает его трудно сделать претензии о морфологической регенерации. Химические повреждения часто центров на печени судов, что делает его полезным методом для изучения сайта и клеток конкретным травм, но также делает его трудным для допроса, на уровне весь орган, другие группы населения, которые могут быть расположены дальше от судов и которые могут способствует регенерации. Несмотря на эти ограничения химических повреждений по-прежнему остается полезным и весьма физиологически соответствующих травмы модель.
Взрослый 70% частичной гепатектомии включает в себя удаление левой и средней долей после перевязки печеночная сосудистую. Ответ на гепатектомии хорошо характеризуется: ампутировали печени 14 дней частичной гепатектомии 70% пост развивается грубо разные архитектуры от того из оригинальной неповрежденной мочку, как гепатоцитов оставшиеся справа и хвостатого лопастями подвергаются гипертрофии и несколько раундов клеточного деления4,5. Это составляет потери массы и функции, но не регенерировать ампутировали две доли и поэтому не заменяет брутто морфологии. В результате травмы ответ на 70% частичной гепатектомии полезно изучить механизмы компенсационного роста с ограниченной регенерацией.
Здесь мы полностью описать протокол для новорожденных частичной гепатектомии лобулярного. Процедура включает в себя соответствующие животных выбор и подготовка, подготовка операционного поля, хирургии и восстановления. Оптимизации и адаптации каждого из этих шагов могут потребоваться для различных видов применения протокола.
Мы активно выступали и оптимизировать этот протокол на дикого типа C57BL/6J щенков (JAX 000664), однако, для изучения различных клеточных популяций и механизмы регенерации, мы также использовали различные трансгенных животных, включая мышей, укрывательство различные КРР и CreERT2 трансгенов и/или стук ins (JAXAxin2CreERT2 018867, и Sox9CreERT2 JAX 018829) в сочетании с флуоресцентные журналистам, как Радуга и mTmG систем (R26VT2/GK3, R26 mT/мг) 22 , 23. Мы нашли не нужно изменить эту методологию для мыши различных штаммов, как не наблюдалось никаких различий в результаты выживания или регенеративного потенциала.
Помимо использования различных животных штаммов, мы также выполняются частичным лобулярного hepatectomies на новорожденных мышей, получавших малых молекул, таких как 4-гидрокси тамоксифен и 5-ethynyl-2′ дезоксиуридина (EdU). Диметилсульфоксид (ДМСО) и этанола были использованы в качестве растворителей, как было установлено, что кукурузное масло было серьёзной причиной заболеваемости. В противном случае, мы обнаружили, что внутрибрюшинное администрации малых молекул не влияет на выживание или регенеративного результатов. Мы предсказывают, что этот протокол будет адаптирована для использования с другими малых молекул допросить различные аспекты регенерации.
Новорожденных мышь операции может быть технически сложным и может потребовать специальных знаний в животных обработки и микроскопических рассечение. Животноводства экспертизы необходимо избегать материнской каннибализм после операции и в течение периода немедленного восстановления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Острые травмы печени традиционно была изучена с помощью химических (ацетаминофен, этанол, тетрахлорид углерода), или хирургические модели (70% частичной гепатектомии). Регенеративные ответ после частичной гепатектомии 70% характеризуется привлечь глобальных гепатоцитов гипертрофия и н?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим P. Чу для выполнения H & E и гистология; и C. Wang и A. Маккарти за полезные дискуссии. Поддержка исследования осуществлялась путем финансирования из Вирджинии и D. K. Ludwig Фонд исследований рака; Национальный сердца, легких и крови института (R01HL058770 и U01HL099999); и Калифорнийский институт регенеративной медицины (RC1 00354) гранты на ИУ Y.R. был поддержан премии карьеры развития человека пограничной науки программы (CDA00017), Немецкий исследовательский фонд (ри 2787/1), Институт стволовых клеток Siebel и Томас и Стейси Siebel фонд (1119368-104-GHBJI). СГН была поддержана NIH (T32GM007365), национальной премии службы исследований (1F30DK108561) и пол и Дейзи Сорос стипендий для новых американцев.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
