Caspase सक्रियण Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता का उपयोग करने के लिए रास्ते प्रकाश
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC); एक इमेजिंग आधारित विधि है कि सर्जक caspases, जो उनके सक्रियण में पहला कदम है की प्रेरित निकटता कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
caspase परिवार apoptosis और जंमजात उन्मुक्ति में आवश्यक भूमिका निभाते हैं । इन के अलावा, एक उपसमूह सर्जक caspases के रूप में जाना जाता है पहले इन रास्ते में सक्रिय हो रहे हैं । इस समूह में caspase-2,-8, और-9, साथ ही भड़काऊ caspases, caspase-1,-4, और-5 शामिल हैं । प्रारंभक caspases सभी सक्रियण प्लेटफॉर्म नामक विशिष्ट multiprotein परिसरों में भर्ती के बाद dimerization द्वारा सक्रिय हैं । Caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) एक इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण है, जहां विभक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन सर्जक caspases से जुड़े करने के लिए अपने सक्रियण प्लेटफार्मों और परिणामी के लिए caspases की भर्ती कल्पना किया जाता है प्रेरित निकटता । यह प्रतिदीप्ति प्रारंभिक caspase सक्रियण के लिए आवश्यक चरणों में से किसी एक का readout प्रदान करता है । विभिन्न माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण के एक नंबर का उपयोग करना, इस तकनीक एक जनसंख्या स्तर पर caspase सक्रियण की दक्षता पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं और साथ ही caspase सक्रियण के कैनेटीक्स और आकार और caspase की संख्या को सक्रिय प्रति सेल के आधार पर परिसरों ।
Introduction
caspase को चिढ़ाने वाले परिवार को apoptosis और जन्मजात उन्मुक्ति 1में अपनी अहम भूमिकाओं के लिए जाना जाता है । क्योंकि उनके महत्व के, निर्धारित कब, कहां, और कैसे कुशलता से विशिष्ट caspases सक्रिय कर रहे है caspase सक्रियकरण रास्ते के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इमेजिंग आधारित प्रोटोकॉल यहां वर्णित caspase सक्रियकरण झरना में जल्द कदम के दृश्य सक्षम बनाता है । इस तकनीक गतिशील प्रोटीन का लाभ लेता है: प्रोटीन बातचीत है कि ड्राइव caspase सक्रियण ।
caspases दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: सर्जक caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, और-12) और जल्लाद caspases (caspase-3,-6, और-7) । जल्लाद caspases कोशिका में विद्यमान dimers के रूप में मौजूद हैं और बड़ी और छोटी उपइकाई 2के बीच दरार द्वारा सक्रिय हैं । जब सक्रिय, वे कई संरचनात्मक और नियामक apoptosis 3में जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन सट । सर्जक caspases पहले caspases को एक मार्ग में सक्रिय कर रहे हैं और आम तौर पर जल्लाद caspases के सक्रियण को ट्रिगर कर रहे हैं. जल्लाद caspases के विपरीत, फलत caspases dimerization 4,5से सक्रिय होते हैं । इस dimerization निष्क्रिय मोनोमर के विशिष्ट बड़े आणविक भार सक्रियण प्लेटफार्मों के रूप में जाना जाता परिसरों की भर्ती द्वारा सुविधा है । सक्रियण प्लेटफार्मों के विधानसभा विशिष्ट प्रोटीन की एक श्रृंखला से नियंत्रित होता है: प्रोटीन बातचीत । इन संरक्षित प्रोटीन बातचीत सर्जक caspase के रूप में मौजूद रूपांकनों द्वारा मध्यस्थता कर रहे है और मृत्यु डोमेन (डीडी), मृत्यु प्रभाव डोमेन (DED) और caspase भर्ती डोमेन (कार्ड) 6 (चित्रा 1a) शामिल हैं । सक्रियण प्लेटफार्मों आम तौर पर एक रिसेप्टर प्रोटीन और एक अनुकूलक प्रोटीन शामिल हैं । रिसेप्टर आमतौर पर एक ligand के बंधन पर सक्रिय है, एक गठन परिवर्तन है कि कई अणुओं के oligomerization के लिए अनुमति देता है उत्प्रेरण. रिसेप्टर तो या तो caspase सीधे या एडेप्टर अणुओं है कि बारी में परिसर में caspase लाने के लिए भर्ती । इस प्रकार, कई caspase अणुओं dimerization की अनुमति करीब निकटता में आते हैं । यह प्रेरित निकटता मॉडल के रूप में जाना जाता है 7. एक बार dimerized, caspase प्रक्रिया है, जो सक्रिय एंजाइम 4,8को स्थिर करने के लिए कार्य करता है । उदाहरण के लिए, Apaf1 apoptosome के विधानसभा cytochrome सी द्वारा एक प्रक्रिया में mitochondria से अपनी रिहाई के बाद शुरू हो रहा है mitochondrial बाहरी झिल्ली permeabilization (MOMP) बुलाया । Apaf1 बारी में भर्ती caspase-9 एक संपर्क है कि दोनों प्रोटीन 9में एक कार्ड मौजूद द्वारा मध्यस्थता है के माध्यम से । इसी तरह के प्रोटीन बातचीत CD95 मौत उत्प्रेरण संकेत जटिल (डिस्क) के विधानसभा में परिणाम है कि caspase-8 सक्रियण की ओर जाता है; PIDDosome, जो caspase-2 को सक्रिय कर सकते हैं; और विभिंन inflammasome परिसरों कि आरंभ caspase-1 सक्रियकरण 10,11,12। इस प्रकार, सर्जक caspases प्रेरित निकटता और dimerization, जिसके बिना सक्रियण नहीं हो जाएगा में जिसके परिणामस्वरूप एक आम तंत्र द्वारा विशिष्ट सक्रियण प्लेटफार्मों पर भर्ती कर रहे हैं ।
Caspase Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) एक इमेजिंग आधारित परख कि सर्जक caspases के सक्रियकरण में यह पहला कदम मापने के लिए विकसित किया गया है, Caspase प्रेरित निकटता के प्रत्यक्ष दृश्य सक्रियकरण मंच निंनलिखित की अनुमति विधानसभा. इस विधि भाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस के गुणों का लाभ लेता है । वीनस पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) है कि दो गैर फ्लोरोसेंट और थोड़ा अतिव्यापी टुकड़े में अलग किया जा सकता है की एक उज्जवल और अधिक photostable संस्करण है: n-वीनस (वीनस n या VN) के टर्मिनस और सी-वीनस (वीनस सी या कुलपति) की टर्मिनस । इन टुकड़ों को फिर से गुना और फ्लोरोसेंट हो जब करीब निकटता 13में करने की क्षमता बनाए रखने । प्रत्येक वीनस टुकड़ा caspase के डोमेन से जुड़े हुए है, जो caspase के ंयूनतम भाग है कि सक्रियण मंच को बांधता है । यह सुनिश्चित करता है कि caspases एंजाइमी गतिविधि बरकरार नहीं है और इसलिए अंतर्जात घटनाओं से जुड़े बहाव की घटनाओं के समवर्ती विश्लेषण संभव है । वीनस टुकड़े जब caspase डोमेन सक्रियण मंच के लिए भर्ती कर रहे हैं और प्रेरित निकटता से गुजरना । (चित्र 1b) । परिणामस्वरूप वीनस प्रतिदीप्ति सही और विशेष रूप से उपसेलुलर स्थानीयकरण, कैनेटीक्स, और एकल कोशिकाओं में सर्जक caspase सक्रियण प्लेटफार्मों की विधानसभा की दक्षता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इमेजिंग डेटा फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा या मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और वास्तविक समय में caspase सक्रियण ट्रैक करने के लिए समय-चूक इमेजिंग: सहित विभिन्न सूक्ष्म दृष्टिकोण के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता; सेलुलर स्थानीयकरण के सटीक निर्धारण के लिए उच्च संकल्प इमेजिंग; और सक्रियण की दक्षता के अंत बिंदु ठहराव ।
यह तकनीक पहले caspase-214के सक्रियकरण की जांच के लिए विकसित किया गया था । जबकि caspase के लिए सक्रियण मंच-2 के लिए PIDDosome, रिसेप्टर PIDD से मिलकर माना जाता है (एक मौत डोमेन के साथ p53-प्रेरित प्रोटीन) और अनुकूलक छापा मारा (चीर एसोसिएटेड इच-1/सीएडी-3 मुताबिक़ प्रोटीन के साथ एक मौत डोमेन), PIDDosome-निर्दलीय caspase-2 सक्रियण रिपोर्ट किया गया है । यह पता चलता है कि caspase-2 के लिए अतिरिक्त सक्रियण प्लेटफॉर्म 15,16मौजूद हैं । caspase-2 सक्रियकरण मंच के पूर्ण घटकों को जानने के बावजूद नहीं, caspase BiFC तकनीक आणविक स्तर 14,17पर caspase-2 संकेत मार्ग के सफल पूछताछ के लिए अनुमति दी गई है । हम भी सफलतापूर्वक भड़काऊ caspases के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है (caspase-1,-4,-5 और-12) 18 और, सिद्धांत रूप में, एक ही दृष्टिकोण को इसी तरह शेष सर्जक caspases में से प्रत्येक का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । इस प्रोटोकॉल इसी तरह अंय रास्ते की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता था dimerization एक प्रमुख संकेत सक्रिय है । उदाहरण के लिए, स्टेट प्रोटीन जानुस् कळेनासे (JAK) द्वारा dimerization निम्नलिखित फास्फारिलीकरण द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 19. इस प्रकार, BiFC प्रणाली स्टेट सक्रियकरण के लिए कल्पना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अंय गतिशील प्रोटीन बातचीत द्वारा विनियमित रास्ते इस्तेमाल किया जा सकता है । निंन प्रोटोकॉल कक्षों में रिपोर्टर्स के परिचय के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है और साथ ही छवि प्राप्ति और विश्लेषण के लिए तरीके भी उपलब्ध कराता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल caspase प्रेरित निकटता को मापने के लिए भाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग पर चर्चा की । इस तकनीक के लिए भाजित वीनस को चुना गया क्योंकि यह बहुत चमकीला, अत्यधिक photostable है और इसका खुलासा तेजी से <sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Bouchier-Hayes लैब जो इस तकनीक के विकास में योगदान के सभी पिछले सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम एक टेक्सास बच्चों के अस्पताल बाल चिकित्सा पायलट पुरस्कार LBH को भाग में वित्त पोषित किया गया । हम Joya चंद्रा (एमडी एंडरसन, ह्यूस्टन, टेक्सास) को उसकी टीम के सहयोग से प्रकाशित आंकड़ों को शामिल करने की अनुमति के लिए धंयवाद । रिएजेंट के विकास Cytometry और NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, और NCRR S10RR024574) और योएल एम Sederstrom की सहायता से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में कोर छंटाई सेल द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
