La Formation de Biofilm induite sur les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques : Techniques d’Identification et de Quantification
Summary
Ce protocole permet au lecteur d’analyser la formation de biofilm induite sur les sels biliaires dans les pathogènes entériques à l’aide d’une approche à multiples facettes pour capturer la nature dynamique des biofilms bactériens par évaluation de la conformité, formation de la matrice extracellulaire substance polymérique, et la dispersion.
Abstract
La formation de biofilm est un processus dynamique, à plusieurs étapes qui se produit chez les bactéries sous des conditions environnementales difficiles ou des moments de stress. Pour les pathogènes entériques, une réponse à un stress important est induite pendant le transit gastro-intestinal et à l’exposition de bile, une composante normale de la digestion humaine. Pour surmonter les effets bactéricides de la bile, de nombreux agents pathogènes entériques forment un biofilm l’hypothèse afin de permettre la survie lorsque le transit à travers l’intestin grêle. Nous présentons des méthodes pour définir la formation de biofilms par le biais de tests d’adhérence de la phase solide ainsi que de détection de matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS) et de visualisation. En outre, évaluation de dispersion de biofilm est présentée pour imiter l’analyse des événements déclenchant la libération des bactéries durant le processus d’infection. Une coloration violette en cristal est utilisée pour détecter des bactéries adhérentes dans un essai d’adhérence haut débit plaque à 96 puits. Évaluation de production EPS est déterminée par deux essais, à savoir la microscopie de coloration de la matrice de l’EPS et les analyse semi-quantitative avec une lectine liant de polyosidique conjugué fluorescent. Enfin, dispersion de biofilm est mesurée à travers des comptages de colonies et le placage. Résultats positifs de tests multiples soutiennent la caractérisation des biofilms et peuvent être utilisés pour identifier la formation de biofilm induite sur les sels biliaires chez les autres souches bactériennes.
Introduction
La formation de biofilm est une stratégie de survie bactérienne importante induite lors des conditions environnementales difficiles. Exposition à des composés bactéricides comme des antibiotiques ou des modifications des éléments nutritifs ou de disponibilité de l’oxygène induit un état de stress chez les bactéries qui peuvent être soulagées par le biais de la formation de biofilm. Un biofilm est caractérisé par l’attachement des bactéries à une surface ou d’autres bactéries et s’accompagne de la sécrétion d’une matrice d’EPS essentiellement composée de polysaccharides1,2,3. La formation de biofilm est un processus dynamique dans lequel une cascade d’événements aboutit à la formation d’une communauté bactérienne adhérente mature1,2,3. Bactéries peuvent produire des adhésines pour faciliter l’attachement précoce tout en déplaçant les profils d’expression génique adhésine afin de renforcer l’attachement au cours de la maturation du biofilm. Simultanément, la production d’EPS se produit pour bien enrober les communautés bactériennes dans une matrice pour protéger les cellules contre le stress initial. Les bactéries contenues dans le biofilm sont à croissance lente ; et à ce titre, rend la plupart des antibiotiques inefficaces. En outre, la croissance lente conserve l’énergie jusqu’à ce que les conditions changent afin de favoriser la croissance bactérienne1,2,3. Après que les dures conditions se sont écoulées, bactéries dispersent le biofilm et reprendre un mode de vie planctonique1,2,3. Traditionnellement, les biofilms sont observées sur les surfaces et représentent un défi clinique persistant en raison des réservoirs d’infection présentes sur cathéters et en vivant dans les dispositifs1,2,3.
La formation de biofilm a été récemment décrit pour plusieurs pathogènes entériques ; bactéries qui infectent l’intestin grêle ou du côlon4. Pour les espèces de Shigella , , l’infection survient dans le côlon humain après un transit par la majorité du tractus gastro-intestinal. Au cours du passage dans l’intestin grêle, Shigella est exposée à la bile ; un détergent dégradant lipides sécrété dans l’intestin pour faciliter la digestion des lipides, tout en tuant en même temps la plupart bactéries5. Les pathogènes entériques ont une capacité unique à résister aux effets bactéricides de bile6. Notre récente analyse utilisées en vivo-comme des combinaisons de glucose et de sels biliaires pour démontrer la formation de biofilm robuste dans S. flexneri et autres espèces de Shigella, pathogène Escherichia coliet Salmonella4. Auparavant, Salmonella enterica serovar Typhi a été montré pour former un biofilm induite par la bile, en raison de la colonisation unique de la vésicule biliaire au cours de l’infection chronique par le7,8,9, 10. en outre, des recherches antérieures avec Vibrio11et Campylobacter12 a démontré la formation de biofilm en réponse à la bile. Donc, les analyses étendu les observations de la formation de biofilm induite par la bile d’autres agents pathogènes et aident à établir la démonstration d’une réponse de pathogènes entériques conservée à la bile. À la différence des biofilms chroniques dans lequel la transcription de gène bactérien est limitée et la sénescence cellulaire peut se produire de1,2,3, nous proposons que le biofilm entérique induite par la bile est plus transitoire dans la nature. Ce transitoire, biofilm virulent est caractérisent par un démontage rapid (comme vu dans le test de dispersion) et amélioré l’expression de gènes de virulence observée dans le biofilm population4,6.
Comme la formation de biofilm est un processus dynamique, aux multiples facettes et l’utilisation des sels biliaires comme un facteur déclencheur n’a été récemment décrit pour les pathogènes entériques plus, les outils et les techniques utilisées sont des applications uniques et créatives des méthodes traditionnelles. Ainsi, sont présentées ici de trois stratégies complémentaires de quantifier plusieurs caractéristiques importantes de la formation de biofilm induite sur les sels biliaires, dont l’adhérence bactérienne, production de la matrice de l’EPS et la dispersion des bactéries viables de biofilm. Ces techniques ont été utilisées principalement pour la recherche avec Shigella; et donc, évaluation d’autres pathogènes entériques peut-être nécessiter optimisation. Néanmoins, les données positives de tous les trois épreuves soutiennent l’identification des biofilms et établissent des protocoles reproductibles pour la formation de biofilm induite sur les sels biliaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse de la formation de biofilm est difficile en raison de la nature dynamique des biofilms et la variabilité entre les souches, les matériaux, laboratoires et analyses. Ici, plusieurs stratégies sont présentées afin de déterminer la formation de biofilm dans entéropathogènes après exposition de sels biliaires avec perspicacité expérimentale prévue pour promouvoir la reproductibilité. Il y a des considérations supplémentaires pour assurer la reproductibilité. Tout d’abord, nous vous recommandons d’…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Rachael B. Chanin et Alejandro Llanos-Chea pour l’assistance technique. Nous remercions Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski et Bobby Cherayil pour les souches utilisées dans cette étude. Ce travail a été soutenu par l’Institut National des allergies et K22AI104755 de subvention des maladies infectieuses (L.C.R.). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
