מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות
Summary
פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.
Abstract
ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.
Introduction
ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.
ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6.
כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים חנין B. רייצ’ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
