담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술
Summary
이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.
Abstract
Biofilm 형성 박테리아 가혹한 환경 조건 또는 스트레스의 시간에에서 발생 하는 동적, 다단계 프로세스입니다. 장 병원 체에 대 한 상당한 스트레스 응답 위장 운송 중 고 노출 되 면 담 즙, 인간의 소화의 정상적인 구성 요소 유도 된다. 담 즙의 살 균 효과 극복 하기 위해 많은 장 병원 체는 소장을 통해 환승 하는 때 생존을 허용 하도록 가상 biofilm을 형성 합니다. 여기 우리가 고체 상 준수 분석으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 매트릭스 감지 및 시각화를 통해 biofilm 형성을 정의 하는 방법론을 제시. 또한, biofilm 분산 평가 감염 과정에서 박테리아의 릴리스를 실행 하는 이벤트의 분석을 모방 하기 위해 제공 됩니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 높은 처리량 96 잘 접시 준수 분석 결과에서 부착 박테리아를 검출 하는 데 사용 됩니다. EPS 생산 평가 즉 두 분석 실험에 의해 결정 됩니다 현미경 EPS 매트릭스와 붙일 활용 된 다 당 류 바인딩 lectin과 반 정량 분석의 얼룩. 마지막으로, biofilm 분산 식민지 및 도금을 통해 측정 된다. 여러 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 특성화를 지원 하 고 다른 세균성 긴장에 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 식별 하기 위해 이용 될 수 있다.
Introduction
Biofilm 형성은 가혹한 환경 조건 동안 유도 하는 중요 한 세균 생존 전략 이다. 살 균 화합물에 노출 항생제 또는 영양소의 변화 또는 biofilm 형성을 통해 완화 될 수 있다 박테리아에 스트레스 상태를 유도 하는 산소 가용성. biofilm 표면 또는 다른 박테리아에 세균성 부착 특징은 고 류1,2,3의 주로 구성 된 EPS 매트릭스의 분 비를 동반 된다. Biofilm 형성 있는 이벤트의 성숙한 부착 세균성 지역 사회1,2,3의 형성에서 절정 동적 과정 이다. 박테리아 생성 adhesins adhesin 유전자 식 프로필 강화 biofilm 성숙 하는 동안 첨부 파일을 이동 하는 동안 초기 연결을 촉진 하기 위하여. 동시에, EPS 생산 코트 초기 스트레스 로부터 세포를 보호 하기 위해 행렬에서 세균성 지역 사회에 발생 합니다. 박테리아는 biofilm에 포함 된는 느린 성장; 따라서, 대부분의 항생제 효과 렌더링. 또한, 느린 성장 조건 세균성 성장1,2,3를 바꿀 때까지 에너지를 절약 합니다. 가혹한 조건, 통과 후 박테리아는 biofilm를 분산 하 고 planktonic 라이프 스타일1,2,3을 다시 시작. 전통적으로, biofilms 표면에 관찰 하 고 감염 저수지 카 테 터 및 주거에 장치1,2,3에 따른 지속적인 임상 도전 대표.
Biofilm 형성 했다 최근 몇 장 병원 체;에 대 한 설명 작은 창 자 또는 결 장4감염 박테리아. Shigella 종의, 에 대 한 감염 위장의 대부분을 통해 환승 후 인간의 콜론에서 발생합니다. Shigella 담 즙;에 노출 되는 동안 작은 창 자 샛길, 동시에 대부분 박테리아5를 죽이 동안 지질 소화 촉진을 소장으로 분 비 지질 저하 세제. 장 병원 체 담 즙6의 살 균 효과 저항 하는 독특한 능력을가지고. 비보에우리의 최근 분석 활용-포도 당 및 S. flexneri 에서 강력한 biofilm 형성을 설명 하기 위해 담 즙 염의 조합 뿐만 아니라 이질균, 병원 성 대장균및 의 다른 종 처럼 살 모 넬 라4. 이전, 살 모 넬 라 enterica serovar 이다 만성 감염7,,89, 중 담 낭의 독특한 식민지 인 담 즙 유도 biofilm를 표시 했다 10. 브리11및 Campylobacter12 사전 연구 biofilm 형성 담 즙에 대 한 응답에서을 설명 하는 또한. 따라서, 분석 담 즙 유도 biofilm 형성 관찰 다른 병원 체를 확장 하 고 담 즙을 보존된 장 병원 체 응답의 데모를 설치 하는 데 도움이. 달리 만성 biofilms는 세균 유전자 전사 제한 되며 세포 노화1,2,3발생할 수 있습니다, 우리는 장의 담 즙 유도 biofilm 더 자연에 과도 제안 합니다. 이 과도 악성 biofilm (로 분산 분석 결과에 본) 급속 한 분해에 의해 hallmarked 고 독성 유전자 발현 biofilm 인구4,6에서 관찰.
Biofilm 형성은 다각적인 동적 프로세스와 담 즙 염의 사용 시작 요소가 최근 가장 장 병원 체에 대 한 설명 되었습니다만, 도구와 기술을 사용 하는 전통적인 방법의 독특하고 창의적인 응용 프로그램. 따라서, 여기에 제시 된 담 즙 소금 유도 biofilm 형성, 세균 부착, EPS 매트릭스의 생산 및 실행 가능한 박테리아의 분산은 biofilm에서를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 특성을 계량 3 무료 전략 있습니다. 이 기술은 주로 이질균;와 연구에 대 한 이용 되었습니다. 그리고 따라서 다른 장 병원 체의 평가 최적화 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 3 개의 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 식별을 지원 하 고 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜 설정.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biofilm 형성 분석 biofilms 그리고 긴장, 재료, 실험실, 및 분석 실험 사이 가변성의 동적 특성으로 인해 도전 이다. 여기 몇 가지 전략 biofilm 형성 재현성을 홍보를 제공 하는 실험적인 통찰력으로 담 즙 염 노출 다음 장 병원 체에서를 확인 하 되 게 됩니다. 재현성을 보장 하기 위해 추가 고려 사항이 있습니다. 맨먼저, 각각 관찰과 발생할 수 있는 변이 때문에 통계적 의미를 확인 하려면 기술 triplicate…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기술 지원에 대 한 레이첼 B. Chanin와 알 레 한 드 야 노스 Chea 감사합니다. 우리가이 연구에 사용 된 긴장에 대 한 앤서니 T. Maurelli, 브라이언 P. 헐리, 알 레 파 사노, 브렛 E. Swierczewski, 그리고 바비 Cherayil 감사 합니다. 이 작품은 알레르기의 국가 학회 및 감염 질환 그랜트 K22AI104755 (C.S.F.)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
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