Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação
Summary
Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.
Abstract
Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.
Introduction
Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma cascata de eventos culmina na formação de uma comunidade bacteriana aderente maduro1,2,3. As bactérias produzem adesinas para facilitar a fixação cedo enquanto deslocamento adesina perfis de expressão de gene para fortalecer o acessório durante a maturação do biofilme. Simultaneamente, a produção de EPS ocorre ao brasão da comunidade bacteriana em uma matriz para proteger as células contra o estressor inicial. Contido dentro do biofilme de bactérias são de crescimento lento; e como tal, a maioria dos antibióticos processa ineficaz. Além disso, o crescimento lento economiza energia até que as condições mudam para favorecer o crescimento bacteriano1,2,3. Depois de tem passado as duras condições, bactérias dispersarem o biofilme e retomar um lifestyle planctônicos1,2,3. Tradicionalmente, os biofilmes são observados em superfícies e representam um desafio clínico persistente devido a reservatórios de infecção presentes em cateteres e dispositivos de em-moradia a1,2,3.
Formação de biofilme foi recentemente descrita por vários patógenos entéricos; bactérias que infectam o intestino delgado ou cólon4. Para espécies de Shigella , , a infecção ocorre no cólon humano após um trânsito através da maioria do tracto gastrointestinal. Durante a passagem através do intestino, Shigella é exposto a bílis; um detergente degradante de lipídios secretado no intestino para facilitar a digestão de lipídios enquanto simultaneamente mata a maioria das bactérias5. Patógenos entéricos têm uma capacidade única de resistir os efeitos bactericidos da bile6. Nossa análise recente utilizado na vivo-como combinações de glicose e de sais biliares para demonstrar a formação de biofilme robusto em S. flexneri , bem como outras espécies de Shigella, patogênica Escherichia colie Salmonela4. Anteriormente, a Salmonella enterica sorovar Typhi mostrou-se para formar um biofilme induzida por bile devido à colonização exclusivo da vesícula biliar durante a infecção crônica7,8,9, 10. Além disso, pesquisas anteriores com Vibrio11e Campylobacter12 demonstraram a formação de biofilme em resposta a bile. Portanto, as análises estendido as observações de formação de biofilme induzida por bile para outros patógenos e ajudam a estabelecer a demonstração de uma resposta de patógeno entérico conservada a bile. Ao contrário de biofilmes crônicas em que transcrição do gene bacteriano é limitada e senescência celular pode ocorrer1,2,3, propomos que o biofilme induzida por bile entérico é mais transitório na natureza. Este transiente, virulenta biofilme é caracteriza por uma rápida desmontagem (como visto no ensaio de dispersão) e reforçada a expressao de genes de virulência observado no biofilme população4,6.
Como formação de biofilme é um processo dinâmico, multifacetado e o uso de sais biliares, como um fator primário só foi recentemente descrito por patógenos entéricos mais, as ferramentas e técnicas utilizadas são únicas e criativas aplicações dos métodos tradicionais. Assim, aqui apresentados são três estratégias complementares para quantificar várias características importantes da formação de biofilme induzida por sais biliares, incluindo a aderência bacteriana, produção da matriz EPS e a dispersão de bactérias viáveis desde o biofilme. Estas técnicas têm sido utilizadas principalmente para pesquisa com Shigella; e, por conseguinte, a avaliação de outros patógenos entéricos pode exigir otimização. No entanto, dados positivos de todos os três ensaios apoiar a identificação de biofilmes e estabelecer protocolos podem ser reproduzidos para a formação de biofilme induzida por sais biliares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos tr?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
