Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs
Summary
Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.
Abstract
Bioélectricité, signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane cellulaire, joue un rôle important dans la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables et nombreux autres processus biologiques, tels qu’embryonnaire structuration du développement. Toutefois, il est nécessaire de in vivo , activité électrique suivi dans l’embryogenèse vertébré. Les avancées des indicateurs de tension fluorescents génétiquement encodé (GEVIs) ont permis d’apporter une solution à ce défi. Nous décrivons ici comment créer un zebrafish indicateur de tension transgéniques à l’aide de l’indicateur de tension établie, ASAP1 (accélération capteur de potentiels d’Action 1), à titre d’exemple. Le kit Tol2 et un promoteur omniprésent zebrafish, ubi, ont été choisis dans cette étude. Nous expliquons aussi les procédés de clonage à des fins spécifiques au site passerelle, transgenèse zebrafish axée sur le transposon Tol2 et le processus d’imagerie des tumeurs embryons et poisson poisson précoce, à l’aide de microscopes ordinaires épifluorescente. En utilisant cette ligne de poissons, nous avons constaté qu’il y a des variations de tension électrique cellulaire durant l’embryogenèse de poisson-zèbre et mouvement larves des poissons. En outre, il a été observé que dans les tumeurs de la gaine de nerf périphérique malin zebrafish quelques, la tumeur des cellules ont été généralement polarisées par rapport aux tissus normaux environnants.
Introduction
Bioélectricité se réfère à la signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane de la cellule1. Échanges ioniques à travers la membrane cellulaire et les changements actuels et potentiels électriques couplés, sont essentiels pour la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables. En outre, bioélectricité et gradients ioniques ont une variété d’autres fonctions biologiques importantes, y compris le stockage de l’énergie, la biosynthèse et transport de métabolite. Signalisation bioélectrique a également été découvert en tant que régulateur de la formation embryonnaire, tels que les axes du corps, le cycle cellulaire et la différenciation des cellules1. Ainsi, il est essentiel pour la compréhension de nombreuses maladies et malformations congénitales humaines résultant de la mauvaise régulation de ce type de signalisation. Patch clamp d’a été largement utilisé pour l’enregistrement des cellules isolées, mais il est loin d’être idéal pour la surveillance simultanée de plusieurs cellules au cours du développement embryonnaire in vivo. En outre, sensibles petites molécules de tension ne sont également pas idéales pour des applications in vivo en raison de leurs spécificités et sensibilités des toxicités.
La création d’une variété de génétiquement encodé tension fluorescent indicateurs (GEVIs) propose un nouveau mécanisme pour régler ce problème et permet une application à l’étude du développement embryonnaire, même si elles étaient initialement destinées à surveillance neurale les cellules2,3. D’entre les GEVIs actuellement disponibles est le capteur accélération de potentiels d’Action 1 (ASAP1)4. Il est composé d’une boucle extracellulaire d’un domaine de détection de tension de phosphatase sensibles de tension et une protéine fluorescente verte circulairement permutée. Par conséquent, ASAP1 permet la visualisation des changements de potentiel électrique cellulaires (polarisation : vert vif ; dépolarisation : vert foncé). ASAP1 a 2 ms et-marche cinétique et peut suivre une éventuelle variation4. Ainsi, cet outil génétique permet à un nouveau niveau d’efficacité en temps réel de surveillance bioélectriques dans des cellules vivantes. Mieux comprendre les rôles de la bioélectricité dans le développement embryonnaire et de nombreuses maladies humaines, comme le cancer, mettra en lumière nouvelle sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est essentiel pour la prévention et le traitement de la maladie.
Poisson zèbre ont fait leurs preuves un puissant modèle animal pour étudier la biologie du développement et des maladies humaines, y compris le cancer5,6. Ils partagent des gènes orthologues 70 % avec les humains, et ils ont biologie vertébrée similaire7. Poisson zèbre fournir relativement facile d’entretien, une grande couvée de œufs, tractable génétique, transgénèse facile et le développement embryonnaire externe transparent, qui en font un système supérieur pour in vivo d’imagerie5,6. Avec une source importante de lignées de poisson mutant déjà présentes et un génome entièrement séquencé, zebrafish fournira une gamme relativement illimitée de la découverte scientifique.
Pour étudier l’in vivo en temps réel l’activité électrique des cellules, nous profitons du système de modèle de poisson-zèbre et ASAP1. Dans cet article, nous décrivons comment incorporer le biocapteur de tension fluorescent ASAP1 dans le génome de poisson-zèbre à l’aide de Tol2 transposon transgénèse et visualiser l’activité électrique cellulaire durant le développement embryonnaire, mouvement larves de poisson et dans la tumeur direct .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les activités électriques niveau cellulaire et tissulaire au cours du développement embryonnaire et la maladie humaine ont été découverts il y a longtemps, en vivo électrique changements dynamiques et leurs rôles biologiques restent encore largement inconnus. Un des défis majeurs est de visualiser et de quantifier les variations électriques. Patch clamp technique est une brèche pour le suivi des cellules isolées, mais son application à des embryons de vertébrés est limitée car ils sont c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux de recherche rapporté dans cette publication a été pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le prix nombre R35GM124913, programme d’incitation pour PI4D de l’Université de Purdue et PVM interne concurrentiel Programme de fonds de la recherche fondamentale. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des agents de financement. Nous remercions la construction Tol2, Michael Lin pour la construction de ASAP1, Koichi Kawakami et Leonard Zon pour le promoteur ubi construire par l’intermédiaire de Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
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