El protocolo MPLEx para Multi-omic análisis de muestras de suelo
Summary
Un protocolo se presenta de forma simultánea extracción de metabolitos, proteínas y lípidos en una muestra de suelo solo, permitiendo tiempos de preparación de muestra reducida y multi-omic análisis de espectrometría de masas de las muestras con cantidades limitadas.
Abstract
Espectrometría de masas (MS)-base metaproteomic integrado, metabolómicos y lipidómicos (multi-omic) estudios están transformando nuestra capacidad de comprender y caracterizar las comunidades microbianas en sistemas ambientales y biológicos. Estas mediciones están permitiendo incluso mejorados análisis de comunidades microbianas de suelo complejas, que son los más complejos sistemas microbianos conocidos hasta la fecha. Análisis multi-omic, sin embargo, tienen problemas de preparación de muestra, puesto que típicamente son necesarias extracciones separadas para cada estudio de omic, así grandemente ampliando el tiempo de preparación y cantidad de muestra necesaria. Para solucionar esta limitación, un 3 en 1 método para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) de la misma muestra de suelo fue creado mediante la adaptación de un enfoque basado en solvente. Este protocolo MPLEx ha demostrado para ser sencilla y robusta para muchos tipos de muestras, incluso cuando se utilizan para cantidades limitadas de muestras complejas. El método MPLEx también permitió la medición rápida multi-omic necesaria para obtener una mejor comprensión de los miembros de cada comunidad microbiana, mientras que la evaluación de los cambios ocurridos en las perturbaciones biológicas y ambientales.
Introduction
Evaluación de las comunidades microbianas del suelo tiene importantes implicaciones para la comprensión de carbono bicicleta y el cambio climático. Sin embargo estudios recientes han puesto de manifiesto dificultades, como la falta de los genomas secuenciados de microbiota en varios tipos de suelo y la función desconocida de muchas de las proteínas detectadas. Resultado de estos desafíos debido al suelo que la comunidad microbiana más compleja conocida hasta la fecha1,2,3. Análisis multi-omic, que combinan los resultados de la metagenómica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos estudios, recientemente se han aplicado en numerosos estudios de suelo para obtener una mayor comprensión en los microbios presentes, mientras que obtener información completa sobre los cambios moleculares que debido a las perturbaciones ambientales1,4,5. Un reto con multi-omic estudios que es la espectrometría de masas (MS)-basado en mediciones metaproteomic, metabolómicos y lipidómicos requieren típicamente un proceso de extracción específico para cada omic que MS compatible6,7 , 8 , 9. estos procedimientos precisa hacen su aplicación extremadamente difícil o imposible cuando sólo hay una cantidad limitada de muestra disponible. Estos desafíos han llevado a investigar un simultáneo metabolitos, proteínas y lípidos (MPLEx) método de extracción capaz de masas o volúmenes de muestra pequeños, mejorar la precisión y proporcionando más rápidas preparaciones de muestra para los análisis de tres 10. hasta la fecha, no hay ningún procedimiento de extracción suelo alternativo que puede lograr todos estos objetivos.
Para habilitar multi-omic global análisis de una muestra de suelo solo, un protocolo de extracción con disolvente orgánico basado en cloroformo, metanol y agua separaciones fue utilizado10. Este método fue desarrollado originalmente para lípido total extracciones9,11 y más recientemente fue modificado para la extracción simultánea de metabolitos, proteínas y lípidos de una sola muestra12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, lo que permite menor cantidad de muestra y variabilidad experimental10. En el protocolo MPLEx, cloroformo no es miscible con agua, que proporciona la base para el trifásico separación química de los componentes de la muestra en distintas fracciones. Por lo tanto, la fase superior acuosa contiene los metabolitos hidrofílicos, seguidos de un disco de proteína y una capa lipídica en la fase de cloroformo del fondo (figura 1). Cuando MPLEx se aplica a la mayoría de los suelos, desechos de partículas se acumulan en la parte inferior de los tubos de muestreo y pueden ser desechado después de que se recogen todas las capas. Cada tipo de suelo puede ser diferente, sin embargo y en suelos altamente orgánicos como turba, los restos de suelo permanece en la capa media y no caen en la parte inferior del tubo de muestreo. MPLEx proporciona varias ventajas al aislamiento de la molécula de múltiples tipos de la misma muestra como 1) pequeñas cantidades de muestra pueden utilizarse para el análisis de multi-omic, 2) multi-omic extracciones de la misma muestra disminución variabilidad general experimental, y 3) mayor número de muestras se puede preparar mucho más rápido para mayor rendimiento de estudios10. Juntos estos beneficios son vitales para ofrecer mejores capacidades de medición para la evaluación de las muestras de suelo y de sus comunidades microbianas complejas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante tener en cuenta que no todos los laboratorios tendrán el mismo equipo disponible para que ciertos métodos, por ejemplo el paso de lisis, pueden ser adaptados. Aquí utilizamos un vórtex y sonicando, sin embargo el uso de una batidora de grano grande 50 mL funcionaría. Si no encuentra un liofilizador con una temperatura del colector de-105 ° C, las muestras pueden ser secadas bajo una corriente de nitrógeno. También tipos de suelo varían mucho y pueden incluir arena, limo, arcilla, turba y Marga (<em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Nathan Johnson por su asistencia en la preparación de las figuras. Esta investigación fue apoyada por el programa de Panamericanos-ómicas que es financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos Oficina de biológicos y la investigación ambiental (programa de Ciencias Genómicas), el Microbiomes en transición (menta) laboratorio dirigido investigación desarrollo Iniciativa en el Pacific Northwest National Laboratory, así como el nacional institutos de salud nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (R01 ES022190) y NIH (P42 ES027704). KEBJ quiere agradecer R21 HD084788 apoyo financiero desarrollar y validar técnicas de extracción de novela multi-omic. Este trabajo fue realizado en el W. R. Wiley ambiental Molecular Ciencias de laboratorio (Page), una instalación de usuario científico nacional de DOE en el laboratorio nacional del Noroeste Pacífico (PNNL). PNNL es un laboratorio nacional de multi-programa operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
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