MPLEx protokollet för Multi-miska analyser av jordprover
Summary
Ett protokoll presenteras för samtidigt utvinna metaboliter, proteiner och lipider från ett enda jordprov, möjliggör reducerat prov förberedelse gånger och aktivera multi-miska masspektrometri analyser av prover med begränsade kvantiteter.
Abstract
Masspektrometri (MS)-baserade integrerade metaproteomic, metabolomiska och lipidomic (multi-miska) studier förändrar vår förmåga att förstå och beskriva mikrobiella samhällen inom miljömässiga och biologiska system. Dessa mätningar även möjliggör bättre analyser av komplexa jord mikrobiella samhällen, som är den mest komplexa mikrobiella system kända hittills. Multi-miska analyser, men har prov förberedelse utmaningar, eftersom separata extraktioner behövs vanligen för varje miska studie, därmed kraftigt förstärka en förberedelsetid och mängden prov krävs. För att lösa denna begränsning, skapades en 3-i-1 metod för samtidig utvinning av metaboliter, proteiner och lipider (MPLEx) från samma jordprov genom att anpassa en lösningsmedelsbaserad strategi. Detta MPLEx protokoll har visat sig vara både enkel och robust för många typer av prov, även när utnyttjas för begränsade mängder av komplexa jordprover. Metoden MPLEx aktiverad också mycket snabb multi-miska mätningarna behövs för att få en bättre förståelse av medlemmarna i varje mikrobiell gemenskapen, medan utvärdera de förändringar som sker vid biologiska och ekologiska störningar.
Introduction
Utvärdera jord mikrobiella samhällen har stor betydelse för att förstå kol cykling och klimat förändring. Nyare studier har emellertid betonat svårigheter, till exempel bristen på sekvenserat genomet för bakterieflora i olika jordtyper och funktionen okänd för många av de proteiner som upptäckts. Dessa utmaningar resultatet på grund av jord att vara gemenskapens mest komplexa mikrobiella känt hittills1,2,3. Multi-miska analyser, som kombinerar resultaten från gjorts, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomiska och lipidomic studier, har nyligen genomförts i ett flertal jord studier att få en större förståelse i Mikroberna som är närvarande, medan få omfattande information om de molekylära förändringar som sker på grund av miljömässiga störningar1,4,5. En utmaning med multi-miska studier är att masspektrometri (MS)-baserat metaproteomic, metabolomiska och lipidomic mätningar kräver vanligtvis en specifika extraheringen för varje miska MS kompatibel6,7 , 8 , 9. dessa exakta förfaranden göra deras genomförande ytterst svårt eller omöjligt när endast en begränsad mängd prov finns. Dessa utmaningar har föranlett oss att undersöka en samtidig metabolit, protein och lipid utvinning (MPLEx) metod kan använda mindre provvolymer eller massorna, förbättra noggrannheten och ge snabbare prov förberedelserna för alla tre analyser 10. hittills, det finns inga alternativa jord utvinning förfaranden som kan uppnå alla dessa mål.
För att aktivera global multi-miska analyser av ett enda jordprov, var en ekologisk vätskeextraktion protokollet baseras på kloroform, metanol och vatten separationer utnyttjad10. Denna metod utvecklades ursprungligen för totala lipid extraktioner9,11 och mer nyligen ändrats för samtidiga utvinning av metaboliter, proteiner och lipider från en enda prov12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, möjliggör mindre prov kvantitet och experimentell variabilitet10. I MPLEx protokoll är kloroform inte blandbar med vatten, vilket utgör grunden för trifasiskt kemisk separation av provet beståndsdelar i olika fraktioner. Den översta vattenhaltiga fasen innehåller därför de hydrofila metaboliter, följt av en protein-disk, och sedan ett lipidskikt i den nedre kloroformfasens (figur 1). När MPLEx appliceras på de flesta jordar, partikulära rester ackumuleras på botten av provtagning rören och kan kastas efter alla lager samlas. Varje jordart kan vara olika, dock, och i mycket organisk jord såsom torv, jord skräp stannar i mellanskiktet och inte faller till botten av provtagning röret. MPLEx ger flera fördelar när isolera flera molekyl skriver från samma prov som 1) mindre prov kvantiteter kan användas för multi-miska analyser, 2) multi-miska extraktioner från samma prov minskningen övergripande experimentella variabilitet, och (3) större antal prover kan förberedas mycket snabbare för högre genomströmning studier10. Tillsammans dessa fördelar är avgörande för att ge bättre mätning kapacitet för utvärdering av jordprover och deras komplexa mikrobiella samhällen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att notera att inte alla laboratorier har samma tillgängliga utrustning så vissa metoder, till exempel lysis steget kan anpassas. Här använder vi vortexa och sonicating, men användningen av en stor 50 mL pärla visp skulle fungera. Om det inte finns en lyophilizer med en collector temperatur kan-105 ° C, kan då prover torkas under en kväve-ström. Även jordtyper varierar kraftigt och kan innehålla sand, silt, lera, torv och loam (etc.), och de kan också variera beroende på pH, salthal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Nathan Johnson för hans hjälp i förberedelserna siffrorna. Denna forskning stöddes av det Pan-omics-Program som finansieras av US Department of Energy’s Office av biologiska och miljöforskning (genomisk Science Program), Microbiomes i övergången (MinT) laboratorium riktad forskningsutveckling Initiativ på Pacific Northwest National Laboratory, liksom de nationella institut för hälsa nationella institutet av Environmental Health Sciences (R01 ES022190) och NIH (P42 ES027704). KEBJ vill tacka R21 HD084788 för ekonomiskt stöd för att utveckla och validera nya multi-miska utvinning tekniker. Detta arbete utfördes i den W. R. Wiley miljömässiga Molecular Sciences laboratorium (EMSL), en DOE nationella vetenskapliga användaren anläggning på Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL är ett nationellt laboratorium för flera program drivs av Battelle för DOE under kontrakt DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A., et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
