JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Изоляция мозгового капилляров из ткани свежий человеческого мозга

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57346
, , , , , , , ,
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,University of Kentucky, 3Department of Neuroscience,University of Kentucky

Summary

Изолированные мозга капилляров из ткани человеческого мозга может использоваться как доклинические модель для изучения барьерную функцию физиологические и патофизиологические условиях. Здесь мы представляем оптимизированный протокол изолировать капилляров мозга от ткани свежий человеческого мозга.

Abstract

Понимание blood – brain барьер функция физиологического и патофизиологические условиях имеет решающее значение для развития новых терапевтических стратегий, которые открывают для улучшения доставки лекарств мозга, улучшить защиту мозга и лечения головного мозга расстройства. Однако изучая человека blood – brain барьер функция является сложной задачей. Таким образом существует острая необходимость соответствующих моделей. В этой связи капилляров мозга, изолированы от человеческого мозга ткани представляют собой уникальный инструмент для изучения барьерную функцию как недалеко от положения человека в естественных условиях максимально. Здесь мы описываем оптимизированный протокол изолировать капилляров из ткани мозга человека в высокий урожай и неизменно высокое качество и чистоту. Капилляры изолированы от свежих человеческий мозг ткани с помощью механической гомогенизации, градиент плотности центрифугирования и фильтрации. После изоляции капилляры человеческий мозг может использоваться для различных приложений, включая утечки анализов, живых клеток и иммунной основе анализов для изучения белков и функции, активности ферментов или внутриклеточная сигнализация. Изолированные человеческий мозг капилляров являются уникальной модели для выяснения регуляции функции человека гематоэнцефалический барьер. Эта модель может обеспечить понимание патогенеза центральной нервной системы (ЦНС), которая будет способствовать развитию терапевтических стратегий для лечения расстройства ЦНС.

Introduction

Blood – brain барьер представляет собой жестко контролируемой интерфейс между кровью и мозга, которая определяет, что попадает в и выходит из мозга. Анатомически эндотелиальные клетки составляют blood – brain барьер и образует комплекс, непрерывной капиллярной сети. Физиологически капиллярная сеть поставляет мозга кислородом и питательными веществами при одновременно утилизации углекислого газа и продуктов обмена веществ. Важно отметить, что доказательства подтверждают, что изменения в барьер вклад многочисленных патологий, в том числе болезни Альцгеймера, эпилепсия и инсульта1,2,3,4,5 , 6 , 7. мозга, эндотелиальные клетки также служат барьером для лечения путем блокирования поглощения наркотиков в мозг, например., химиотерапии глиобластомы мультиформной после опухоль резекции8,9, 10. В этой связи изолированных человеческий мозг капилляры представляют собой уникальный ex vivo гематоэнцефалического барьера модель, напоминающей барьерные свойства в-vivo, который позволяет для изучения барьерной функции и дисфункции в области здравоохранения и болезни. В этой статье мы предоставляем протокол изолировать капилляров мозга от человеческого мозга в неизменно высокое качество капилляров и выход для изучения blood – brain барьер.

В 1969 году Siakotos и др. 11 были первыми сообщить изоляции капилляров мозга от ткани говядину и человеческого мозга, используя плотность градиентного центрифугирования и стекла бисера столбец разделения. Позже, Гольдштейн и др. 12 улучшить этот метод, добавив несколько фильтрации шаги для уменьшения количество ткани, необходимых для изучения капилляров мозга, изолированные от крыс, сохраняя при этом метаболической активности транспорта глюкозы. С тех пор исследователи оптимизированы процедуры капиллярного изоляции много раз, улучшение капиллярного модель метод и мозг с каждой итерации по13,,1415. К примеру, Pardridge и др. 16 изолированные говядину капилляров с помощью ферментативного пищеварения, а не механической гомогенизации, а затем впоследствии передается капиллярного подвеска через сетчатый фильтр 210 мкм и стеклянный шарик столбец. Эти изменения улучшить пятно исключения Трипановый синий изолированных мозга капилляров и таким образом повысить жизнеспособность эндотелиальных клеток. В начале 90-х годов Даллера и др. 17 изолированных говядину и крыса капилляров, которые были ясно нейрональных загрязнения и поддерживается метаболической активности, gamma-глютамил транспептидаза (γ-GTase) и щелочной фосфатазы. В 2000 году Миллер и др. 18, используется изолированных крыса и свиного мозга капилляров в сочетании с confocal микроскопии Показать накопление транспорта субстратов в просвете капилляров. Впоследствии наша лаборатория продолжает оптимизировать процедуры капиллярного изоляции мозга и мы создали транспорта анализов для определения Р-гликопротеина (P-gp)19,20,21, рак молочной железы сопротивление белка (BCRP)22,23и множественной лекарственной устойчивости белка 2 (Mrp2)24 транспортной деятельности. В 2004 году мы опубликовали два доклада, где мы использовали изолированные крыса капилляров мозга для расследования различных сигнальных путей. В Hartz и др. 21, мы обнаружили, что пептид эндотелина-1 быстро и обратимо сократить функции транспорта P-gp в капилляров мозга, действуя через эндотелина рецептор B (BET) рецептор, синтаза оксида азота (NOS) и Протеинкиназа С (PKC). В Бауэр и др. 19, мы продемонстрировали выражение рецептора pregnane X ядерных рецепторов (PXR) и показал PXR-модуляция функции P-gp выражение и транспорта в капилляров мозга. В экспериментах с трансгенных мышей гуманизированные PXR мы расширили эту линию исследований и показал в естественных условиях ужесточения барьера по upregulating P-gp через hPXR активации25. В 2010 году Hartz и др. 26 использовать этот подход для восстановления P-gp белков и перевозочная деятельность трансгенных человеческих амилоида прекурсоров протеина (Хапп) мышей, которые overexpress hAPP. Кроме того восстановление P-gp в hAPP мышей значительно сокращен40бета амилоида (значения) и значения42мозга уровнях.

Помимо изучения сигнальных путей, изолированные мозга капилляров может использоваться для определения изменений в проницаемость капилляров, который мы называем капиллярной утечки. В частности Техас красный утечки пробирного используется для оценки утечки Люминесцентную краску, Техас красный от капиллярного просвета со временем и эти данные затем используются для анализа масштабов утечки. Увеличение капиллярной утечки, по сравнению с теми из капилляров управления указывают изменения в физической неприкосновенности blood – brain барьер2. Это ценно, потому что есть многочисленные государства болезни, связанные с нарушением барьер, например., эпилепсия, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и черепно-мозговой травмы27,28,29, 30. Другие группы также использовали изолированные капилляров различать сигнальных путей, которые регулируют выражение протеина и транспортной деятельности белки31,,3233,34, 35,,3637. Наконец мы продолжаем оптимизировать этот метод для изоляции капилляров мозга человека, и недавно мы показали увеличение выражение P-gp на человека blood – brain барьер у пациентов с эпилепсией, по сравнению с захватом свободных управления лиц38 . Взятые вместе, эти события свидетельствуют, что изолированные мозга капилляров может служить универсальная модель для изучения барьерную функцию.

Различные in vivo, ex vivoи в пробирке blood – brain барьер модели были использованы в фундаментальные исследования и промышленные наркотиков скрининг, главным образом с целью тестирования доставки лекарств в мозг39,40,41 ,42,,4344. В дополнение к изолированной ex vivo капилляров мозга текущие blood – brain барьер модели включают в silico модели, в пробирке клеточной культуры изолированных мозга капиллярных эндотелиальных клеток или увековечен клеточных линий из различных видов, в пробирке культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), которые дифференцируются в капиллярных эндотелиальных клеток мозга и microfluidic модели на чипе.

В silico модели наиболее часто используются в разработке лекарств для отбора кандидатов наркотиков на основе прогнозируемых поглощения, распределение, метаболизм и экскрецию (ADME) свойства. Методы, такие как количественные структура свойства отношения (QSPR) и количественные структура активность отношения (QSAR) модели являются популярные методы, используемые в высокопроизводительного скрининга библиотек для прогнозирования мозга проникновения наркотиков кандидатов 45 , 46. Эти модели являются полезными для экрана молекул барьер проникновения свойств.

Betz и др. 47 создана монослои искусственный мозг капиллярных эндотелиальных клеток как система гематоэнцефалического барьера модель в пробирке . В vitro клетки культуры моделей с использованием свежие ткани или увековечен эндотелиальных клеток линии как эндотелиальные клетки человеческого мозга microvessel (hCMECs) может быть еще одним инструментом высокопроизводительного скрининга для проникновения мозга или механистической исследования. Однако модели культуры капиллярных эндотелиальных клеток мозга не хватает физиологического касательное напряжение внутри просвета капиллярного кровотока, ограничены в целом биологических сложности и претерпевают изменения в выражение и локализация компонентов важный барьер такие жесткие соединения белков поверхности рецепторы, транспортеры, ферменты и ионных каналов48,,4950. И наоборот эндотелиальных монослои, производный от hPSCs, имеют низкий сахарозы проницаемости по сравнению с hCMEC/D3 культур и содержат поляризованные выражение некоторых blood – brain барьер перевозчиков, молекулы адгезии и плотных51, 52. Однако, эти клетки также подлежат изменению свойств в культуре, и системы должны быть проверены для своего резюме в vivo барьерные свойства52.

Новые тенденции в blood – brain барьер исследования включают в себя использование систем 3D культуры ткани для создания искусственных капилляров, используя технологию орган на чипе для создания microfluidic приборы, или используя полые волокна технологии53, 54 , 55. искусственные капилляров, однако, имеют значительно больших диаметров (100 – 200 мкм) чем капилляров мозга (3 – 7 мкм). Следовательно, сдвига силы в vitro не напоминают полностью ситуацию в естественных условиях . Этот вопрос рассматривается в «blood-brain-barrier-on-a-chip» microfluidic приборы, где искусственных оболочек формы «кровь» и «мозг» отсеков и жидкости перекачивается через эти устройства генерации microfluidic сдвига. Аналогичным образом, Сопредседатель культур клеток сосудистой гладкой мускулатуры и эндотелиальных клеток в различных комбинациях с Астроциты также были использованы с технологией полые волокна для воссоздания реологические параметры под в vivo условий56 , 57 , 58. Однако, неясно, насколько хорошо эта модель отражает другие свойства blood – brain барьер, таких, как транспорт, метаболизм, сигнализации и др. Эти искусственные капилляров и чип модели подходят для высокопроизводительного скрининга наркотиков, но и ячейки, используемые для создания этих моделей также могут изменяться во время культуры.

Замороженные и фиксированной мозга ломтиками или первичного мозга, которые культур капиллярных эндотелиальных клеток являются дополнительные модели, которые могут использоваться дляизучения человеческого microvasculature5,59,,6061. Например иммуногистохимия фиксированной мозговой ткани, используется для определения белков локализации и выражение в здоровых по сравнению с пораженной ткани.

Помимо тканей срезы и модели в пробирке капилляров мозга свежевыделенных, описанные выше могут быть использованы для изучения функции гематоэнцефалического барьера. Ограничения этой изолированной капиллярного модели включают в себя трудности, чтобы получить свежие человеческий мозг ткани, отсутствие астроциты и нейронов и относительно длительной изоляции процесса. Преимущество капилляра модели изолированных мозга состоит в том, что эта модель напоминает ситуацию в естественных условиях и, следовательно, может использоваться для характеристики барьерной функции и дисфункции. Важно отметить, что она может использоваться также различать сигнальных механизмов, с помощью множества анализов и молекулярных методов3,19,,6263.

Наша лаборатория имеет доступ к ткани как свежие и замороженные человеческий мозг через Сандерс-Браун центр по проблемам старения (СИБ #B15-2602-M)64. В этом контексте вскрытия следовать стандартным протоколом, мозги, полученные в < 4 h и все процедуры соответствуют руководящим принципам наилучшей практики NIH биопрепаратов65. Этот уникальный доступ к ткани человеческого мозга, мы создан и оптимизирован протокол изолировать капилляров мозга от ткани человеческого мозга, что приводит к высокой урожайности нетронутыми, жизнеспособных человеческий мозг капилляров. Две общих конечных точек интереса должны определить выражение протеина и деятельности. В этой связи мы и другие создали различные анализы, которые могут использоваться с изолированной черепно-мозговой капилляров для изучения белков и уровень активности. Эти анализы включают в себя Западный blotting, простой Западной пробирного, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР), Зимография, анализов деятельности транспорта, и капиллярной утечки анализов. Эти анализы позволяют исследователям изучить изменения в функции барьера в патологических условиях жизни людей, определить пути, которые регулируют выражение протеина и деятельности и определить фармакологических цели для лечения blood – brain барьер связанные заболевания.

Вместе, в свежей изолированных мозга капилляров может служить в качестве надежных и воспроизводимых моделью blood – brain барьер. Особенно эта модель может сочетаться с много различных анализов для определения широкий спектр конечных точек для изучения барьерную функцию.

Protocol

Приводимая ниже информация основана на текущей безопасности и нормативных стандартов в университете Кентукки, Лексингтон, Кентукки, США. Предосторожности обратитесь к программе института биологической безопасности и самые последние правила и рекомендации перед началом работы с тка?…

Representative Results

Изоляции от ткани человеческого мозга выход подвеска, обогащенный капилляров мозга человека (рис. 1B) с небольшим количеством более крупных судов, красных кровяных клеток, другие отдельные ячейки и некоторые ячейки мусора. Разветвленных некоторые капи?…

Discussion

Настоящий Протокол описывает изоляции нетронутыми и жизнеспособной человеческий мозг капилляров из свежих ткани. В этом разделе мы подробно обсудить следующее: 1) изменения к протоколу, 2) устранение общих ошибок, 3) ограничения техники, 4) значение модели в отношении существующих и альт?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим и признать д-р Питер Нельсон и Соня Андерсон на берегу ткани мозга Великобритании-ADC для предоставления всех человеческий мозг образцы тканей (номер гранта NIH: P30 AG028383 из Национального института по проблемам старения). Мы благодарим Matt Hazzard и Tom Долан, информационные технологии, научные технологии и участия факультет, Университет Кентукки графический помощи. Этот проект получил поддержку номер 1R01NS079507 грант от национального института неврологических нарушений и инсульта (чтобы B.B.) и номер 1R01AG039621 грант от национального института по проблемам старения (до A.M.S.H.). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национальный институт неврологических расстройств и инсульта или Национальный институт по проблемам старения. Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4°C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 l Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri Dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer’s disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer’s disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer’s disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood–brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer’s disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer’s subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis – Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -. C., Lee, T. -. H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Tags

Cerebral CapillariesBlood-brain BarrierIsolationHomogenizationFicoll Density GradientFiltrationCentrifugation
check_url/fr/57346?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image