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Neurosciences

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57346
, , , , , , , ,
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,University of Kentucky, 3Department of Neuroscience,University of Kentucky

Summary

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Abstract

Función de barrera blood – brain de comprensión bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que tienen la promesa de mejorar la entrega de la droga de cerebro, mejorar la protección del cerebro y tratar el cerebro trastornos. Sin embargo, es difícil estudiar la función humana barrera blood – brain. Así, hay una necesidad crítica de modelos apropiados. En este sentido, los capilares del cerebro aislados de tejido cerebral humano representan una herramienta única para estudiar la función de barrera cerca de la situación humana en vivo como sea posible. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar los tubos capilares del tejido de cerebro humano en un alto rendimiento y con pureza y calidad constante. Los capilares están aislados del tejido de cerebro humano fresco mediante homogeneización mecánica, gradiente de densidad centrifugación y filtración. Después del aislamiento, los capilares del cerebro humano pueden utilizarse para diversas aplicaciones, incluyendo ensayos de fugas, imágenes de células vivas y ensayos inmune para estudiar la expresión de la proteína y función de la actividad enzimática y señalización intracelular. Los capilares del cerebro humano aisladas son un modelo único para aclarar la regulación de la función humana barrera blood – brain. Este modelo puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de sistema nervioso central (SNC), que ayudará al desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de trastornos de la CNS.

Introduction

La barrera blood – brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato – encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerebro células endoteliales también sirven como una barrera al tratamiento mediante el bloqueo de la absorción de drogas en el cerebro, por ejemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme tras tumor resección8,9, 10. en este sentido, los capilares del cerebro humano aisladas representan un modelo único ex vivo barrera blood – brain que se asemeja a la barrera propiedades en vivo, que permite el estudio de la función de barrera y disfunción en la salud y la enfermedad. En este artículo, nos proporcionan un protocolo para aislar los capilares cerebrales del cerebro humano con una alta calidad capilar y rendimiento para el estudio de la barrera blood – brain.

En 1969, Siakotos et al. 11 fueron los primeros en informar el aislamiento de los capilares del cerebro bovino y humano de tejido de cerebro usando densidad gradiente centrifugación y vidrio grano columna separación. Más tarde, Goldstein et al. 12 mejorar este método mediante la adición de varios pasos de filtración para disminuir la cantidad de tejido necesario para el estudio de los capilares del cerebro aislados de ratas, manteniendo la actividad metabólica del transporte de glucosa. Desde entonces, los investigadores optimizan el procedimiento de aislamiento capilar numerosas veces, mejorando el método y el cerebro modelo capilar con cada iteración13,14,15. Por ejemplo, Pardridge et al. 16 aislados bovinos capilares mediante digestión enzimática, en lugar de homogeneización mecánica y posteriormente pasa una suspensión capilar a través de un filtro de malla de 210 μm y una columna de bolas de vidrio. Estas modificaciones mejoraron la mancha de exclusión azul de tripano de capilares del cerebro aislado y así, aumentaron la viabilidad de las células endoteliales. En la década de 1990, Dallaire et al. 17 aislados capilares bovinos y ratas que eran claras de contaminación neuronal y mantener la actividad metabólica de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GTase) y fosfatasa alcalina. En el año 2000, Miller et al. 18, utiliza aislado de rata y los capilares del cerebro porcino en combinación con la microscopía confocal para mostrar la acumulación de sustratos de transporte en el lumen de los capilares. Posteriormente, nuestro laboratorio ha continuado optimizar el procedimiento de aislamiento capilar cerebral y hemos establecido ensayos de transporte para determinar la P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, cáncer de mama resistencia proteína (BCRP)22,23y 2 (Mrp2) de la proteína de resistencia a múltiples drogas actividad de transporte de24 . En 2004, hemos publicado dos informes donde utilizamos los capilares del cerebro aislado de rata para investigar diferentes vías de señalización. En Hartz et al. 21, se encontró que el péptido endotelina-1 rápidamente reversible reduzca la función de transporte de P-gp en capilares del cerebro, actuando a través del receptor de endothelin receptor B (ETB), óxido nítrico sintasa (NOS) y proteína quinasa C (PKC). En Bauer et al. 19, demostramos la expresión del receptor del receptor nuclear pregnano X (PXR) y mostró PXR-modulación de la función de transporte y expresión de P-gp en los capilares del cerebro. En experimentos con ratones transgénicos de PXR humanizados, hemos ampliado esta línea de investigación y mostró en vivo apretando de la barrera por regular P-gp a través de la activación de hPXR25. En 2010, Hartz et al. 26 utiliza este enfoque para restablecer la expresión de la proteína P-gp y transporte actividad en ratones de (hAPP) la proteína precursora del amiloide humanos transgénicos que sobreexpresan hAPP. Además, restauración de P-gp en hAPP ratones redujeron significativamente la amiloide beta (Aβ)40y niveles de Aß42cerebro.

Además de estudiar vías de señalización, los capilares del cerebro aislado pueden utilizarse para determinar los cambios en la permeabilidad capilar que denominamos fuga capilar. En particular, el análisis de fuga de Texas Red se utiliza para evaluar la fuga de colorante fluorescente rojo de Texas desde el lumen capilar con el tiempo y estos datos entonces se utilizan para analizar las tasas de salida. Tasas de fuga capilar aumento en comparación con las de los capilares de control indican cambios en la integridad física de la barrera blood – brain2. Esto es valioso porque hay numerosos Estados de enfermedad asociados con la interrupción de la barrera, por ej., epilepsia, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y cerebral traumática lesión27,28,29, 30. Otros grupos también han utilizado los capilares aislados para discernir las vías de señalización que regulan la expresión de la proteína y la actividad de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Por último, hemos seguido optimizar este método para el aislamiento de los capilares del cerebro humano y, recientemente, nos mostraron mayor expresión de P-gp en el humana barrera hemato – encefálica en pacientes con epilepsia en comparación con los individuos del control de asimiento-libre38 . Tomados juntos, estos desarrollos demuestran que los capilares del cerebro aislado pueden servir como modelo para estudiar la función de barrera.

Varios en vivo, ex vivoy en vitro barrera blood – brain los modelos se han utilizado en investigación básica y la detección de drogas industriales, principalmente con el objetivo de la prueba de entrega de la droga al cerebro39,40,41 ,42,43,44. Además aisladas ex vivo capilares del cerebro, modelos actuales de la barrera hemato – encefálica incluyen en silico modelos, en vitro cultura de célula de las células endoteliales capilares cerebrales aislados o líneas de células inmortalizadas de varios especie, en vitro cultura de células de madre pluripotenciales humanas (hPSC) que se diferencian en células endoteliales capilares del cerebro y modelos de microfluidos en un chip.

Modelos in silico se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos de selección de candidatos de la droga basados en predicha de la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) propiedades. Métodos tales como modelos de relación (QSPR) propiedad de la estructura cuantitativa y cuantitativa estructura-actividad relación (QSAR) son métodos populares utilizados en el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas predecir penetración cerebral de fármacos candidatos 45 , 46. estos modelos son útiles para las moléculas de la pantalla de propiedades de penetración de barrera.

Betz et al. 47 estableció monocapas de células endoteliales capilares cerebrales cultivadas como un sistema de modelo en vitro barrera blood – brain. In vitro de la célula cultura modelos tejido fresco o líneas celulares endoteliales inmortalizado como las células endoteliales del microvessel cerebral humano (hCMECs) pueden ser otra herramienta de proyección de alto rendimiento para la penetración del cerebro o estudios mecanísticos. Sin embargo, modelos de cultura de célula endotelial capilar cerebral falta el estrés fisiológico del esquileo del flujo de sangre dentro del lumen capilar están limitados en su complejidad biológica en general y experimentan cambios en la expresión y localización de los componentes importantes de la barrera como las proteínas de Unión estrecha, iones, transportadores, enzimas y receptores de la superficie de canales48,49,50. Por el contrario, monocapas endoteliales derivan de hPSCs, tienen sacarosa baja permeabilidad en comparación con las culturas hCMEC/D3 y contener expresión polarizada de algunos transportadores de la barrera blood – brain, moléculas de adhesión y uniones estrechas51, 52. sin embargo, estas células también están sujetos a cambio de las propiedades en la cultura y el sistema debe ser validado para su recapitulación en vivo barrera propiedades52.

Nuevas tendencias en la investigación de la barrera hemato – encefálica incluyen utilizando sistemas de cultivo de tejidos 3D para crear capilares artificiales, utilizando la tecnología del órgano-on-chip para generar dispositivos microfluídicos, o utilizando la tecnología de fibra hueca53, 54 , 55. los capilares artificiales, sin embargo, tienen significativamente mayores diámetros (100 – 200 μm) que los capilares cerebrales (3 – 7 μm). Por lo tanto, el esquileo las fuerzas en vitro no completamente se asemejan a la situación en vivo . Esto se aborda en los dispositivos microfluídicos “blood-brain-barrier-on-a-chip”, donde compartimientos de “sangre” y “cerebro” de forma artificial de las membranas y líquidos son bombeados a través de estos dispositivos microfluídicos fuerzas de esquileo. Del mismo modo, co-cultivos de células endoteliales en varias combinaciones con astrocitos y células musculares lisas vasculares también han sido utilizados con la tecnología de fibra hueca para recrear parámetros reológicos presentes en vivo las condiciones56 , 57 , 58. sin embargo, no está claro cómo este modelo refleja otras propiedades de la barrera hemato – encefálica como transporte, metabolismo, señalización y otros. Estos modelos artificiales capilar y chip son adecuados para la detección de alto rendimiento de drogas, pero las células utilizadas para generar estos modelos también están sujetos a cambio en la cultura.

Rebanadas de cerebro congelado y fijo o cerebro primario, cultivos de células endoteliales capilares son modelos adicionales que pueden utilizarse paraestudiar la microcirculación humana5,59,60,61. Por ejemplo, inmunohistoquímica del tejido de cerebro fija se utiliza para determinar la localización de proteínas y expresión en sana en comparación con el tejido enfermo.

Además de los modelos en vitro y rebanadas de tejido capilares descrita, recientemente aisladas del cerebro pueden ser utilizados para estudiar la función de la barrera blood – brain. Limitaciones de este modelo capilar aislada incluyen la dificultad para obtener tejido cerebral humano fresco, ausencia de astrocitos y neuronas y un proceso relativamente largo de aislamiento. Una ventaja del modelo capilar cerebral aislado es que este modelo se parece a la situación en vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para caracterizar la disfunción y la función de barrera. Lo importante, también puede ser utilizado para discernir mecanismos de señalización mediante multitud de ensayos y técnicas moleculares3,19,62,63.

Nuestro laboratorio tiene acceso a ambos tejidos frescos y congelados de cerebro humano a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M)64. En este contexto, las autopsias siguen un protocolo estándar, se obtienen cerebros en < 4 h y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Dado este acceso único para el tejido cerebral humano, establecimos y optimizado un protocolo para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano que se traduce en un alto rendimiento de tubos capilares del cerebro humano intacto y viable. Dos extremos comunes de interés son para determinar la expresión de la proteína y la actividad. En este sentido, nosotros y otros hemos establecido varios ensayos que pueden utilizarse para estudiar la expresión de la proteína y niveles de actividad con los capilares del cerebro aislado. Estos ensayos incluyen el Western Blot, Western Simple ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), zymography, ensayos de actividad de transporte, y ensayos de fuga capilar. Estos ensayos permiten a los investigadores a estudiar los cambios en la función de barrera en condiciones patológicas humanas, determinar las vías que regulan la actividad y expresión de la proteína e identificar dianas farmacológicas para el tratamiento de la barrera hemato – encefálica asociada enfermedades.

Tomados juntos, recién los capilares del cerebro aislado pueden servir como un modelo robusto y reproducible de la barrera blood – brain. Sobre todo, este modelo puede combinarse con muchos diferentes ensayos para determinar una amplia gama de puntos finales para el estudio de la función barrera.

Protocol

La siguiente información se basa en la seguridad actual y normas reglamentarias de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY, Estados Unidos. Como precaución de seguridad, consulte programa de seguridad biológica de la institución y los reglamentos y recomendaciones más actuales antes de trabajar con tejido humano. PRECAUCIÓN: Tejido humano puede ser una fuente de patógenos transmitidos por la sangre, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), …

Representative Results

Los aislamientos de tejido de cerebro humano producen una suspensión enriquecida en capilares del cerebro humano (figura 1B) con pequeñas cantidades de recipientes más grandes, células de sangre rojas, otras células y algunos restos de células. Algunos capilares se ramifican, y, en algunos, las células de sangre rojas son atrapadas en los lúmenes capilares. El capilar típico tiene un diámetro de 3 – 7 μm y es aproximadamente de 100-200 μm largo …

Discussion

El presente Protocolo describe el aislamiento de los capilares del cerebro humano intacto y viable de tejido fresco. En esta sección, discutimos en detalle lo siguiente: 1) modificaciones en el protocolo 2) solución de problemas de errores comunes, 3) limitaciones de la técnica, 4) la importancia del modelo con respecto a los existentes y modelos alternativos barrera blood – brain, y 5). aplicaciones potenciales de los capilares del cerebro humano aislado.

El protocolo descrito aquí está …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos y reconocemos el Dr. Peter Nelson y Sonya Anderson en el Banco de tejido cerebral de UK-ADC para proporcionar cerebro humano todas las muestras de tejido (NIH número de concesión: P30 AG028383 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento). Agradecemos a Matt Hazzard y Tom Dolan, servicios de tecnología de información, tecnología académica y compromiso de la Facultad, Universidad de Kentucky para asistencia gráfica. Este proyecto fue apoyado por 1R01NS079507 número de subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular (por B.B.) y grant número 1R01AG039621 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento (a A.M.S.H.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular o el Instituto Nacional sobre envejecimiento. Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4°C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 l Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri Dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM
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Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).
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